Dans la pratique du laboratoire, lorsque vous travaillez avec des micro-organismes, vous devez constamment prendre des mesures pour que la vaisselle, milieux nutritifs, les outils métalliques utilisés lors des travaux ne contenaient pas de germes. À cette fin, les méthodes de stérilisation suivantes sont utilisées :
Stérilisation à la vapeur surchauffée sous pression ;
Stérilisation à la vapeur qui coule ;
Stérilisation à l'air chaud ;
Désinfection.
La meilleure façon de stériliser est de traiter divers objets avec de la vapeur surchauffée dans un appareil spécial - des autoclaves.
Autoclave et stérilisation à la vapeur surchauffée sous pression
Les autoclaves sont des chaudières en métal (acier, fonte ou cuivre) à double paroi et un couvercle massif, qui est hermétiquement scellé avec des boulons et un joint en caoutchouc. Selon le système de chauffage, les autoclaves sont à vapeur, électriques et à feu (Fig. 42). L'obtention de vapeur à haute pression et surchauffée à une température de 115 à 120 °C dans un autoclave permet de détruire à la fois les cellules végétatives et les spores microbiennes en 20-30 minutes.
Tous les articles qui ne se détériorent pas à haute température sont stérilisés en autoclave : divers liquides (eau, milieux nutritifs ne contenant pas de composants glucidiques), verrerie, outils métalliques, coton, gaze, papier, etc.
Dans les cas où certaines substances ne résistent pas au régime normal de stérilisation en autoclave (notamment les milieux de culture contenant des sucres), elles sont stérilisées en autoclave à une température de 112°C pendant 20 minutes, ainsi que dans des conditions plus douces.
Aux hautes pressions de vapeur surchauffée dans l'autoclave, la température de chauffage augmente en conséquence ; cela provoque une caramélisation des sucres ajoutés à certains milieux de culture, de sorte que les milieux deviennent impropres à la détermination des propriétés physiologiques des microbes.
La pression à l'intérieur de l'autoclave est mesurée à l'aide d'un manomètre monté dans le couvercle ou le corps de l'autoclave. En cas d'augmentation excessive de la pression, une soupape de sécurité se déclenche automatiquement, qui est située, selon la conception, soit sur le couvercle, soit sur la surface latérale de la paroi de l'autoclave. Un jet de vapeur, sifflant hors de la soupape de sécurité, avertit de la nécessité d'arrêter le chauffage. Si le chauffage n'est pas arrêté, l'autoclave peut exploser.
Un thermomètre est parfois placé dans une poche spéciale sur le couvercle de l'autoclave, avec laquelle la température de stérilisation est mesurée. Il y a un support à l'intérieur de l'autoclave, sous lequel l'eau est versée à travers un tube avec un entonnoir situé à l'extérieur de l'autoclave. De plus, les autoclaves sont équipés d'une sortie de vapeur et d'air et d'une sortie d'eau.
Les règles de manipulation de l'autoclave lors de la stérilisation sont les suivantes : l'appareil est rempli d'eau par l'intermédiaire d'un entonnoir et d'un tube dont le niveau doit être en dessous du support. Les articles à stériliser sont placés dans des conteneurs métalliques spéciaux et chargés dans un autoclave. Le couvercle de l'autoclave est vissé.
Après avoir ouvert la vanne de sortie de vapeur et d'air, le chauffage commence. Dès que l'eau bout, la vapeur qui en résulte commence à chasser l'air de l'autoclave. La vanne de sortie de vapeur est maintenue ouverte jusqu'à ce que de la vapeur sèche en sorte en un flux continu. Cela indique une élimination complète de l'air de l'autoclave. Ensuite, le robinet est fermé. La vapeur qui s'accumule avec un chauffage supplémentaire dans de plus en plus Suite, augmente la pression dans l'autoclave, et donc la température. Lorsque vous travaillez avec un autoclave, vous pouvez être guidé par le tableau des relations entre la pression de vapeur et la température (tableau 4).
Une fois que la flèche du manomètre a atteint la pression souhaitée (la température dans l'autoclave correspondra à la température de stérilisation acceptée), régler le chauffage de l'autoclave de manière à ce que la pression soit maintenue au même niveau pendant le temps requis. A la fin de la stérilisation, arrêter le chauffage. Lorsque la température dans l'autoclave baisse et que l'aiguille du manomètre tombe à zéro (la pression dans l'autoclave devient égale à la pression atmosphérique), ouvrez avec précaution la vanne de sortie de vapeur, libérez la vapeur et, en ouvrant le couvercle de l'autoclave, retirez le matériau. N'ouvrez pas la vanne de sortie de vapeur prématurément, avant que la pression dans l'autoclave n'ait chuté. Une forte baisse de pression dans la chambre de l'autoclave provoquera une ébullition violente des liquides chauffés à des températures supérieures à 100°C, c'est-à-dire au-dessus du point d'ébullition à la pression atmosphérique normale. Les liquides bouillant violemment mouilleront ou même pousseront les bouchons de coton hors des récipients - le travail sera gaspillé. Les milieux nutritifs se détérioreront, car la microflore de l'air se développe facilement sur les bouchons humides, pénètre et infecte l'environnement. De plus, l'ouverture de l'autoclave sous haute pression est dangereuse pour le travailleur.
Cependant, dès que l'aiguille du manomètre s'arrête à zéro, l'autoclave doit être ouvert immédiatement, sinon de la condensation commencera à couler sur les bouchons et les fera également mouiller. Pour éviter de mouiller les bouchons avec de l'eau de condensation, recouvrez-les de papier avant la stérilisation.
Les matériaux placés dans un autoclave seront stérilisés de manière fiable en 20-30 minutes si la température est maintenue à 120 ° C, ce qui correspond à une pression de 2 atm (19,61 * 10 000 N / m2) ou 1 atm au-dessus de la pression normale sur un manomètre. L'autoclave peut être utilisé avec succès pour la stérilisation de milieux avec de la vapeur fluide ; dans ce cas, le couvercle de l'autoclave n'est pas vissé.
Chaudière Koch et stérilisation à la vapeur de fluide
La chaudière Koch est un cylindre en tôle galvanisée ou en cuivre à double paroi avec un couvercle en forme de casque conique (Fig. 43). Le couvercle a un trou au milieu pour un thermomètre. A l'extérieur, la chaudière de Koch est recouverte d'une couche de matériau calorifuge : amiante, linoléum, etc.
Une cloison (support) est placée à l'intérieur de la chaudière, divisant l'espace interne de la chaudière en deux sections : supérieure et inférieure. La partie inférieure est remplie d'eau dont le niveau est réglé sur la jauge en verre : l'eau ne doit pas recouvrir la partie supérieure du support. Les articles à stériliser sont placés dans la partie supérieure de la chaudière dans des seaux en treillis qui sont installés les uns sur les autres. Après avoir fermé la chaudière avec un couvercle, ils commencent à chauffer l'eau qu'elle contient. Le début de la stérilisation est le moment où le thermomètre indique 98-100°C. En l'absence de thermomètre, le début de la stérilisation est le moment où la vapeur commence à s'échapper vigoureusement du trou du couvercle de la chaudière. Ainsi, les articles à stériliser pendant le fonctionnement de la chaudière seront toujours dans un flux de vapeur en circulation.
La méthode de stérilisation à la vapeur fluide est largement utilisée dans la pratique de laboratoire en raison de sa simplicité et de sa disponibilité. La vapeur qui s'écoule stérilise principalement les milieux nutritifs, qui changent de propriétés lorsqu'ils sont chauffés au-dessus de 100°C : protéines, glucides et gélatineux. Pour ces milieux, la méthode de stérilisation à la vapeur fluide est la plus appropriée.
L'inconvénient de la méthode de stérilisation à la vapeur qui coule est sa durée, car pour une stérilisation complète du milieu, il est nécessaire d'effectuer un chauffage répété dans une chaudière pendant un certain temps - de 20 minutes à 1,5 heures (en moyenne 30-45 minutes), en fonction du volume de liquide à intervalles de 24 heures. Il est recommandé de conserver tout l'intervalle de temps entre le chauffage du milieu dans un thermostat à 25-30 ° C.
Un seul chauffage dans une chaudière Koch provoque la mort des seules cellules microbiennes végétatives, mais les spores peuvent persister. Lorsque le milieu nutritif stérilisé est conservé dans des conditions favorables (à température ambiante, voire mieux dans un thermostat), certaines des spores restantes vont germer et se transformer en cellules végétatives jusqu'au lendemain. Un chauffage répété entraînera également la mort de ces cellules nouvellement développées. Enfin, le troisième chauffage après une journée de maintien du milieu dans un thermostat assurera une stérilité complète. Cette méthode est appelée stérilisation fractionnée. V Travaux pratiques Au lieu de la stérilisation avec un écoulement de vapeur dans une chaudière Koch, une stérilisation classique en autoclave à 112 ° C avec une contre-pression de 0,5 atm pendant 15 à 20 minutes est souvent utilisée.
Armoire de séchage et stérilisation à air chaud
En pratique de laboratoire, pour la stérilisation de la verrerie microbiologique, il est nécessaire de disposer d'une étuve ou dite étuve Pasteur. Le principe de l'étuve et de l'étuve Pasteur est le même. Les fours sont uniquement de forme rectangulaire et les armoires de séchage peuvent avoir une forme non seulement rectangulaire, mais également cylindrique (Fig. 44 et 45). Dans ces appareils, la stérilisation est réalisée à l'air chaud (chaleur sèche) à une température de 160°C pendant 1 heure ou à une température de 150°C pendant 2 heures.
Les fours Pasteur et les étuves de séchage sont des appareils creux à double paroi avec des portes doubles et hermétiques. A l'extérieur, pour l'isolation thermique, elles sont recouvertes d'une couche d'amiante. De l'air chaud circule entre les murs, qui est chauffé soit par des spirales électriques, soit par des brûleurs à gaz. À l'intérieur de l'armoire, il y a plusieurs (généralement deux ou trois) étagères perforées. Il y a deux ouvertures dans la partie supérieure du meuble : une pour un thermomètre et l'autre pour la ventilation. Les armoires de séchage électriques sont les plus pratiques.
Dans les armoires de séchage de dernière conception, quatre niveaux de chauffage sont prévus, qui peuvent être activés par un régulateur spécial placé sur la paroi latérale de l'armoire. Le degré de chauffage requis est obtenu en allumant une, deux, trois ou les quatre spirales électriques, et la séquence d'allumage des spirales peut être quelconque.
Dans les armoires de séchage, en plus de la verrerie, vous pouvez stériliser la gaze, le coton, bien qu'il soit toujours préférable de les autoclaver, car ils jaunissent à une température de 160 ° C. Les produits en caoutchouc ne peuvent pas être stérilisés dans une armoire de séchage, car ils ne supportent pas les températures élevées - ils deviennent cassants et se détériorent. Les liquides bout à 150-160°C et changent de composition chimique.
Pour éviter la contamination ultérieure des articles stérilisés par des microbes de l'air, ils sont emballés dans du papier avant la stérilisation. Les boîtes de Pétri sont emballées dans du papier en 2 morceaux afin qu'il n'y ait pas de fissures dans l'emballage. Les tubes en verre et les pipettes sont également emballés dans du papier, d'abord séparément, puis en paquets de 10 à 20 pièces. L'emballage des tubes et des pipettes doit être extrêmement doux, les protégeant complètement. surface extérieure de la communication avec l'air. Les flacons, tubes à essai, flacons avant stérilisation à l'air chaud sont fermés avec des bouchons en coton et des capsules en papier.
La température dans l'armoire de séchage ne doit pas dépasser 170 ° C, car à cette température, les cotons-tiges brunissent et les emballages en papier deviennent cassants et même carbonisés. Le début de la stérilisation est le moment où le thermomètre indique 150-160°C. Une fois le temps nécessaire à la stérilisation écoulé, le chauffage est arrêté. Pour protéger la vaisselle des fissures, ne stérilisez que la vaisselle sèche et n'ouvrez l'armoire après la stérilisation que lorsque la température à l'intérieur descend à 50-70 ° C. Les petits objets de laboratoire, tels que les boucles en platine, les aiguilles, les pincettes, les ciseaux, etc., peuvent être stérilisés en les allumant simplement sur la flamme d'un brûleur à gaz (ou d'une lampe à alcool).
Désinfection
La désinfection en laboratoire de microbiologie doit être pratiquée très souvent. Les désinfectants les plus courants sont les suivants : solution à 3 5% d'acide phénique et solutions d'autres phénols supérieurs, solution à 50 70 % d'alcool éthylique, la même concentration d'alcool butylique, solution de formol à 4 %, 1 à 2 % de chloroforme et solutions de toluène, solution de chloramine à 0,5%, etc.
Dans les laboratoires de microbiologie des conserveries, les surfaces des tables, de la vaisselle, des sols et des murs des locaux sont désinfectées. Pour désinfecter la surface des tables, vous pouvez utiliser non seulement des solutions d'alcool éthylique, mais également des solutions d'acide phénique.
La désinfection des dispositifs d'égout dans les conserveries et autres entreprises alimentaires est effectuée avec une solution d'eau de Javel à 5-10 %. Pour la désinfection des récipients en verre recyclé dans les conserveries, on utilise de l'eau chlorée contenant au moins 100 mg de chlore actif dans 1 litre. Pour préparer une telle solution, prenez eau de Javel, mélanger avec une petite quantité d'eau jusqu'à l'obtention d'une masse laiteuse épaisse. Ce mélange est ajouté à de l'eau, bien agité et laissé pendant une journée. L'eau de Javel réagit pour former de l'oxyde de calcium hydraté - Ca (OH) 2 - et du chlore actif. Ca (OH) 2 se dépose au fond, la solution au dessus du sédiment après clarification s'avère transparente, de couleur verdâtre. Le trempage des récipients dans une telle solution dure 10 minutes. Après la chloration, le récipient doit être soigneusement rincé à l'eau courante.
Stérilisation
La stérilisation est un dé-provisionnement, c'est-à-dire la libération complète des objets environnement des micro-organismes et de leurs spores.
La stérilisation s'effectue de différentes manières :
1) physique (exposition à des températures élevées, rayons UV, utilisation de filtres bactériens) ;
2) chimique (utilisation de divers désinfectants, antiseptiques);
3) biologique (utilisation d'antibiotiques).
Dans la pratique en laboratoire, des méthodes physiques de stérilisation sont généralement utilisées.
La possibilité et l'opportunité d'utiliser l'une ou l'autre méthode de stérilisation sont dues aux caractéristiques du matériau à stériliser, à ses propriétés physiques et chimiques.
Méthodes physiques
La calcination dans la flamme d'un brûleur ou d'un flambage est une méthode de stérilisation dans laquelle l'objet est complètement épuisé, car les cellules végétatives et les spores de micro-organismes meurent. Habituellement, les boucles bactériologiques, les spatules, les pipettes, les lames de microscope et de couverture et les petits instruments sont calcinés. Les ciseaux et scalpels ne doivent pas être stérilisés par calcination, car la surface de coupe s'émousse sous l'influence du feu.
Stérilisation à la chaleur sèche
La stérilisation à la chaleur sèche ou à l'air chaud est réalisée dans des étuves Pasteur (étuves de séchage). Le poêle Pasteur est une armoire à double paroi faite de matériaux résistants à la chaleur - métal et amiante. L'armoire est chauffée à l'aide de brûleurs à gaz ou de radiateurs électriques. Les armoires chauffées électriquement sont équipées de régulateurs pour assurer la température requise. Pour contrôler la température, un thermomètre est inséré dans le trou de la paroi supérieure de l'armoire.
Les liquides (milieux de culture, solution isotonique de chlorure de sodium, etc.), les objets en caoutchouc et en matières synthétiques ne peuvent pas être stérilisés à la chaleur sèche, car les liquides bout et se déversent, et le caoutchouc et les matières synthétiques fondent.
Faire bouillir la stérilisation
L'ébullition est une méthode de stérilisation, qui garantit qu'il n'y a pas de spores dans le matériel à stériliser. Ils sont utilisés pour le traitement de seringues d'instruments, d'ustensiles en verre et en métal, de tubes en caoutchouc, etc. La stérilisation à la vapeur sous pression est effectuée dans un autoclave. Cette méthode de stérilisation est basée sur l'exposition des matériaux à stériliser à de la vapeur d'eau saturée à une pression supérieure à la pression atmosphérique. À la suite d'une telle stérilisation, avec un seul traitement, les formes végétatives et sporulées des micro-organismes meurent. Autoclave (Fig. 12) - une chaudière massive, recouverte à l'extérieur d'un boîtier métallique, hermétiquement scellée par un couvercle, qui est fermement vissée à la chaudière avec des boulons à charnière.
La température et la durée d'autoclavage des milieux de culture sont déterminées par leur composition, indiquée dans la recette de préparation du milieu de culture. Par exemple, des milieux simples (gélose mésopatamique, bouillon mésopatamie) sont stérilisés 20 minutes à 120°C (1 atm). Cependant, à cette température, il est impossible de stériliser des milieux contenant des protéines natives, des glucides et d'autres substances qui sont facilement modifiées par chauffage. Les milieux contenant des glucides sont stérilisés de manière fractionnée à 100°C ou en autoclave à 112°C (0,5 atm) pendant 10-15 minutes. Divers liquides, appareils avec tuyaux en caoutchouc, bouchons, bougies bactériennes et filtres sont stérilisés pendant 20 minutes à 120°C (1 atm).
La stérilisation à la vapeur d'eau s'effectue dans un appareil Koch. Cette méthode est utilisée dans les cas où l'objet à stériliser évolue à une température supérieure à 100°C. Avec un courant de vapeur, les milieux de culture contenant de l'urée, des glucides, du lait, des pommes de terre, de la gélatine, etc. sont stérilisés.
L'appareil de Koch (chaudière) est un cylindre métallique gainé à l'extérieur (pour réduire le transfert de chaleur) avec du feutre ou de l'amiante. Le cylindre est fermé par un couvercle conique avec une sortie de vapeur. Il y a un support à l'intérieur du cylindre, au niveau duquel de l'eau est versée. Un seau avec un trou est placé sur le support, dans lequel le matériel à stériliser est placé. L'appareil Koch est chauffé au gaz ou à l'électricité. Le temps de stérilisation est compté à partir du moment où la vapeur s'échappe vigoureusement sur les bords du couvercle et à partir de la sortie de vapeur. Stérilisé dans les 30-60 minutes. A la fin de la stérilisation, le chauffage est arrêté. Retirer le seau avec le matériel de l'appareil et laisser à température ambiante jusqu'au lendemain. L'échauffement est effectué pendant 3 jours consécutifs à une température de 100 ° C pendant 30 à 60 minutes. Cette méthode est appelée stérilisation fractionnée. Au premier chauffage, les formes végétatives des microbes meurent et les spores restent. Pendant la journée, les spores ont le temps de germer et de se transformer en formes végétatives, qui meurent le deuxième jour de stérilisation. Puisqu'il est possible que certaines des spores n'aient pas eu le temps de germer, le matériel est conservé pendant encore 24 heures, puis une troisième stérilisation est effectuée. La stérilisation à la vapeur qui coule dans l'appareil Koch ne nécessite pas de contrôle particulier, car la stérilité des milieux de culture préparés sert d'indicateur du bon fonctionnement de l'appareil. Vous pouvez également stériliser à la vapeur qui coule dans un autoclave avec le couvercle ouvert et la vanne de vidange ouverte.
Stérilisation par irradiation ultraviolette
La stérilisation par rayons UV est réalisée à l'aide d'installations spéciales - lampes bactéricides. Les rayons UV ont une activité antimicrobienne élevée et peuvent provoquer la mort non seulement des cellules végétatives, mais aussi des spores. L'irradiation UV est utilisée pour stériliser l'air dans les hôpitaux, les salles d'opération, les institutions pour enfants, etc. Au laboratoire de microbiologie, la boîte est traitée aux rayons UV avant le travail.
Méthodes chimiques
Ce type de stérilisation est utilisé dans une mesure limitée, et il sert principalement à prévenir la contamination bactérienne des milieux de culture et immuno produits biologiques(vaccins et sérums).
Des substances telles que le chloroforme, le toluène et l'éther sont le plus souvent ajoutées aux milieux nutritifs. S'il est nécessaire de débarrasser le milieu de ces conservateurs, il est chauffé au bain-marie à 56°C (les conservateurs s'évaporent).
Pour conserver les vaccins, les sérums, ils utilisent du merthiolate, de l'acide borique, du formol, etc.
Stérilisation biologique
La stérilisation biologique est basée sur l'utilisation d'antibiotiques. Cette méthode est utilisée dans la culture de virus.
B. Technologie de détail pour la production de sérum bovin dans les abattoirs de Lyon
Le sang a déjà été prélevé sur 1 000 animaux, le sérum a été mis en bouteille et près de 20 000 enfants ont été distribués gratuitement.
Ainsi, il a été montré qu'une production industrielle de lactosérum en abattoir dans le respect des règles d'asepsie et des réglementations sanitaires est possible.
La société de sérothérapie ne fournit pas de garanties supplémentaires - elle n'a pas le droit d'autopsier l'animal donneur.
La technologie utilisée dans notre production peut sembler moins stricte en termes d'asepsie que la méthode classique. Mais elle a un grand avantage en vitesse, puisque le sérum est entièrement produit le jour du prélèvement sanguin.
Si les circonstances actuelles nous ont poussés à produire du sérum à l'abattoir, il est clair qu'il s'agit d'une mesure temporaire, puisque les sérums hématogènes et médicinaux ne peuvent être produits que dans un institut spécialisé.
Sélection d'animaux... A Lyon, le Dr Gieux, le vétérinaire en chef de l'abattoir, et le Dr Fontenay, le vétérinaire d'inspection, sélectionnent eux-mêmes des donneurs parmi les bovins destinés à approvisionner notre ville en viande. L'animal sélectionné est marqué sur l'épaule droite pour faciliter un contrôle supplémentaire.
Après l'abattage, les organes des animaux sont soigneusement contrôlés. L'autopsie est connue pour être la méthode la plus sûre pour détecter la tuberculose.
Les chirurgies ultérieures montreront que le sérum de l'animal malade n'a jamais été consommé.
Prélèvement de sang d'animaux... Dans la salle de prélèvement sanguin, le taureau donneur est maintenu solidement par un joug automatique.
Le vétérinaire désinfecte la peau à l'iode au niveau du cou de l'animal et pratique une incision dans la veine jugulaire avec un scalpel. La ponction veineuse est réalisée avec un trocart stérilisé par ébullition prolongée. Dès l'apparition du sang, une tubulure en caoutchouc autoclavable est fixée au trocart pour le connecter directement et aseptiquement au défibrinateur.
La technologie du défibrinateur et le procédé de stérilisation du défibrinateur sont décrits ci-dessous.
Chaque animal reçoit 8 à 10 litres de sang, qui est pesé sur une balance sous l'appareil.
Méthodes de stérilisation
Pour faciliter l'inspection sanitaire, chaque défibrinateur est étiqueté avec les données de l'animal donneur.
A noter que le prélèvement sanguin est réalisé de manière aseptique en raison du circuit fermé de tous les composants : trocart, tuyau en caoutchouc et défibrinateur, qui sont pré-stérilisés.
L'étiquette de date de prélèvement sanguin accompagne le prélèvement sanguin depuis le moment de la ponction veineuse jusqu'à ce qu'il soit converti en sérum et conservé dans des réfrigérateurs.
Sang défibrinant... Dans la plupart des établissements de sérum, le sang versé dans des récipients en verre sépare le sérum sous la pression d'une charge. Dans ces conditions, le sang d'abord obtenu à partir de bovins contient peu de sérum (environ 10 %).
Ainsi, le Centre de Sérothérapie de Lyon utilise une technologie spéciale qui donne 50% de sérum, et de plus en un temps plus court.
Le Dr Merier a pu développer cette méthode en partie après ses découvertes à l'Institut royal de Rotterdam et à l'Institut de sérothérapie de Milan.
Dès que le sang est prélevé dans ces instituts, il est défibriné dans des machines stériles ressemblant à des barattes à beurre.
En 5 minutes, le sang est renversé dans un vaisseau à l'abri de l'air. Il est nécessaire d'observer avec précision le temps de défibrination : en son absence, une coagulation peut se produire, et en cas d'excès, une hémolyse (due à la rupture des érythrocytes). Il est nécessaire d'utiliser une horloge de laboratoire qui permet de marquer exactement 15 minutes de défibration.
En haut de la fig. 4, on peut voir que le nombre d'échantillons de sang a atteint 1000, ce qui est inscrit sur l'emblème du Centre.
Centrifugation.
Immédiatement après la défibration, les appareils sont transférés dans un laboratoire situé à quelques mètres de la salle de prélèvement sanguin. Le contenu de chaque défibrinateur est traité séparément afin que le sérum d'un animal malade puisse être retiré.
Le sang non coagulé après défibration est passé dans un séparateur Alfa-Laval (un séparateur de lait que nous avons adapté pour la production de lactosérum).
Sous l'action de la force centrifuge, le sang est divisé en parties égales : le rouge contient des boules rouges, et le sérum de maquillage transparent (la fibrine reste sur les lames du défibrinateur).
À partir d'un animal, 8 à 10 litres de sang ou environ 4 à 5 litres de sérum sont obtenus, qui sont versés dans une bouteille en Pyrex, stérilisée à 180 ° C.
Une étiquette défibrinateur est apposée sur le flacon, et une fiche de contrôle sanitaire est remplie sous le même numéro.
Un antiseptique spécial est ajouté au lactosérum, calculé pour qu'il soit suffisamment actif sans perturber la transparence et le goût du lactosérum. Pour 1 litre de sérum, ajoutez 100 ml d'une solution contenant 1: 1000 de formol et 1: 5000 de syunuxol.
(Entre les préparations, la centrifugeuse est soigneusement désinfectée avec un antiseptique.)
En principe, la fraction de sang rouge doit être retournée aux bouchers pour la fabrication de boudin, mais le plus souvent elle reste inutilisée, elle peut donc être utilisée pour préparer du sirop en utilisant la technologie suivante.
Cas particuliers de fabrication de sirop de sang... Le sirop a deux avantages : il permet d'utiliser la partie rouge du sang qui reste après avoir reçu le sérum, et il a un goût agréable qui plait aux enfants.
En raison du manque de glycérine, il est difficile de préparer un sirop pour une conservation à long terme, mais vous pouvez préparer un produit très actif dans de l'eau et le donner aux enfants 2 à 3 cuillères à soupe par jour. Ajouter 20% à la partie rouge du sang boire de l'eau et stocker le sirop dans les glaciers pendant que les contrôles sanitaires sont en place.
Ajoutez ensuite une part égale de sirop 100% sucre (le sucre peut être obtenu à partir des fiches des collectifs auxquels le sirop est destiné).
Un extrait de citron ou d'orange est ajouté au sirop pour neutraliser le goût du sang, et mis en bouteille dans des flacons de 250 ml.
Tyndallisation du sérum.
Immédiatement après centrifugation, c'est-à-dire moins d'une heure après le prélèvement sanguin, le sérum est typé à une température de 56°C pendant une heure.
Pour ce faire, il est immergé dans un bain-marie à température maintenue automatiquement. La tyndallisation à cette température (à un sérum coagule plus élevé) est nécessaire pour la stérilisation partielle du sérum, bien que la rapidité de sa préparation soit en elle-même un gage d'asepsie.
Il convient de noter que chaque pot de 5 litres est muni de l'étiquette d'origine du défibrinateur, de sorte que la numérotation du sérum correspond à la numérotation de l'animal donneur.
Classeur de contrôle... La carte permet de vérifier à tout moment l'origine de l'animal donneur, les étapes de préparation du lactosérum, la date de mise en bouteille, ainsi que la répartition du lactosérum.
Contrôle sanitaire... Pendant que les récipients sont conservés au réfrigérateur, les vétérinaires-inspecteurs s'occupent du contrôle sanitaire des animaux donneurs. Après leur abattage, une autopsie approfondie est pratiquée pour révéler les moindres symptômes de tuberculose.
Si une maladie est détectée, le sérum correspondant peut être facilement prélevé. On sait que le sang de chaque animal est traité séparément et que le sérum est contenu dans des flacons séparés et numérotés.
Centre de Sérothérapie du Comité Public d'Hygiène de l'Enfance du Massacre de Lyon
Numéro de contrôle …
Lactosérum bovin en litres
Carte et étiquette
La carte et l'étiquette ci-dessus évitent toute confusion.
A Lyon, les mesures sanitaires sont particulièrement strictes, car le même vétérinaire sélectionne les animaux, prélève le sang et contrôle la viande.
Stérilisation du matériel... Les sérums animaux sont un excellent terreau pour les microbes et ne peuvent être que partiellement stérilisés. A des températures supérieures à 56°, elles coagulent et se troublent si un fort antiseptique est ajouté. Par conséquent, dans toutes les opérations de production de sérum, une stérilité maximale est requise ; l'équipement doit être sécurisé avant utilisation.
Les défibrinateurs individuels sont stérilisés de la manière suivante : ils sont remplis d'une solution antiseptique la nuit avant le prélèvement sanguin, et quelques heures avant le prélèvement sanguin, ils sont débarrassés de l'antiseptique à l'aide d'un robinet situé dans le bas de l'appareil. Les centrifugeuses utilisées pour fabriquer le lactosérum sont également traitées avec un antiseptique, y compris entre le traitement du contenu de chaque défibrinateur.
Dans un four électrique à une température de 180 ° C, toute la verrerie est stérilisée, y compris les récipients de cinq litres pour stocker le sérum.
Les flacons de sérum de 250 ml sont également stérilisés à 180°C. Pour simplifier l'opération, les plats sont dans des cartons qui servent à la mise en bouteille et à la distribution au public.
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La stérilisation est représentée par des méthodes physiques, chimiques, mécaniques et biologiques et diverses méthodes.
La faisabilité de l'utilisation d'une méthode de stérilisation particulière et de ses méthodes dépend des caractéristiques du matériau à stériliser, de ses propriétés physiques et chimiques.
La durée de la stérilisation dépend de l'objet à stériliser, de l'agent stérilisant et de sa dose, ainsi que de la température et de l'humidité de l'environnement.
Méthode physique de stérilisation
La méthode physique de stérilisation comprend le séchage, l'incinération et la calcination, l'ébullition, la pasteurisation et la tyndalisation, l'air chaud (chaleur sèche), les ultrasons, les rayonnements ultraviolets et radioactifs, le courant haute fréquence, la lumière du soleil.
Le moyen le plus courant de stériliser des articles soumis à des températures élevées est le feu, l'air chaud et la vapeur saturée sous pression.
Le feu est utilisé pour brûler des objets infectés qui n'ont aucune valeur (papiers inutiles, vieux papiers peints, chiffons, ordures), pour désinfecter les crachats des patients tuberculeux, les cadavres de personnes et d'animaux morts d'infections particulièrement dangereuses, ainsi que pour brûler et calciner divers objets...
La cuisson et la calcination sont largement utilisées dans la pratique microbiologique pour la désinfection des instruments, de la verrerie de laboratoire et pharmaceutique.
La calcination à la flamme d'un brûleur ou d'un flambage est une méthode de stérilisation, dans laquelle l'objet est complètement épuisé, car les cellules végétatives, les kystes et les spores de micro-organismes meurent également.
Les boucles, spatules, pipettes, lames, lamelles, petits instruments et autres objets contaminés sont généralement stérilisés par calcination s'ils ne peuvent pas être bouillis. Il n'est pas recommandé de stériliser les ciseaux et scalpels par allumage, car la surface de coupe s'émousse sous l'influence du feu.
L'une des méthodes de stérilisation physique les plus simples et les plus courantes utilisées dans la pratique médicale est la stérilisation à l'air chaud (chaleur sèche). La stérilisation à la chaleur sèche est réalisée dans des armoires de séchage (étuves Pasteur). L'air chaud sec a un effet bactéricide, virucide, sporicide et est principalement utilisé pour la stérilisation de la verrerie (verrerie de laboratoire - boîtes de Pétri, flacons, pipettes, éprouvettes, etc.), ainsi que des produits métalliques stérilisables à la vapeur sous pression.
De plus, la chaleur sèche est utilisée pour stériliser les articles en porcelaine et les substances résistantes à la chaleur (talc, argile blanche), ainsi que les huiles minérales et végétales, les graisses, la vaseline, la lanoline, la cire. Le mode le plus efficace pour cette méthode de stérilisation, qui assure la mort des formes végétatives et des spores, est une température de 160 à 180 degrés pendant 15 minutes.
Les nutriments, les solutions isotoniques, les objets en caoutchouc et en matières synthétiques ne peuvent pas être stérilisés par la chaleur sèche, car les liquides bout et se déversent, et le caoutchouc et les matières synthétiques fondent.
La stérilisation à la vapeur saturée sous pression est la méthode la plus fiable et la plus souvent utilisée pour stériliser les pansements, l'eau, certains médicaments, les milieux de culture, les équipements mous, les instruments, ainsi que pour désinfecter les déchets de matériel contaminé.
En pratique chirurgicale pansement, les blouses de chirurgiens, les sous-vêtements de la personne opérée sont désinfectés à la vapeur en autoclave. La stérilisation à la vapeur sous pression est effectuée dans un appareil spécial - des autoclaves.
L'autoclavage détruit complètement tous les micro-organismes et spores. La méthode de stérilisation à la vapeur sous pression est basée sur le chauffage du matériau avec de la vapeur saturée à une pression supérieure à la pression atmosphérique. L'action combinée de la haute température et de la vapeur rend cette méthode particulièrement efficace. Dans ce cas, les cellules végétatives et les spores de micro-organismes meurent.
Les spores microbiennes meurent dans les 10 minutes sous l'influence de la vapeur d'eau saturée et des formes végétatives - de 1 à 4 minutes.
Le pouvoir bactéricide élevé de la vapeur saturée est dû au fait que sous l'influence de la vapeur d'eau sous pression, les protéines de la cellule microbienne gonflent et coagulent, ce qui entraîne la mort des cellules microbiennes.
L'effet bactéricide de la vapeur d'eau saturée est renforcé par une surpression.
La stérilisation en autoclave s'effectue selon différents modes.
Ainsi, des milieux nutritifs simples (viande - gélose peptonée et viande - bouillon peptoné) sont stérilisés pendant 20 minutes à 120 degrés (1 atm.). Mais dans ce mode, il est impossible de stériliser des milieux contenant des protéines, des glucides et d'autres substances facilement modifiables par chauffage.
Les milieux contenant des glucides sont stérilisés dans un autoclave à 0,5 atm. 10 - 15 minutes ou vapeur à écoulement fractionné.
À l'aide de températures élevées, il est possible de détruire les formes les plus persistantes de micro-organismes pathogènes (y compris ceux qui forment des spores) non seulement à la surface des objets désinfectés, mais également dans leurs profondeurs.
C'est le grand avantage de la haute température comme moyen fiable de stérilisation. Cependant, certains objets se détériorent sous l'influence d'une température élevée et dans ces cas, il est nécessaire de recourir à d'autres méthodes et moyens de désinfection.
L'épuisement complet des matériaux et objets qui ne permettent pas l'utilisation de la stérilisation à haute température est obtenu par une stérilisation répétée à la vapeur d'eau dans l'appareil Koch à une température ne dépassant pas 100 degrés. Cette méthode est appelée stérilisation fractionnée. Cela se résume au fait que les formes de spores non tuées restantes de microbes, en une journée dans un thermostat à 37 degrés, germent en cellules végétatives, dont la mort survient lors de la stérilisation ultérieure de cet objet avec un écoulement de vapeur.
Le traitement avec un écoulement de vapeur est effectué trois fois pendant 30 à 40 minutes. Le chauffage unique du matériau à une température inférieure à 100 degrés est appelé pasteurisation. La pasteurisation a été proposée par Pasteur et est principalement destinée à la destruction de micro-organismes majoritairement exempts de spores. La pasteurisation s'effectue à 60 - 70 degrés pendant 15 à 30 minutes, à 80 degrés pendant 10 à 15 minutes.
Dans la pratique microbiologique, la pasteurisation de l'inoculum est souvent utilisée pour isoler des cultures pures de micro-organismes sporulés et pour identifier la capacité des micro-organismes à former des spores.
Pour les liquides qui perdent leur goût et d'autres qualités précieuses lorsqu'ils sont exposés à des températures élevées (lait, jus de baies et de fruits, bière, milieux de culture contenant des glucides ou de l'urée, etc.), la stérilisation à la vapeur fluide est effectuée à 50 - 60 degrés pour 15 - 33333330 minutes ou à 70 - 80 degrés pendant 5 - 10 minutes. Dans le même temps, les microbes de résistance moyenne meurent, et plus persistants et les spores restent.
La stérilisation fractionnée 5 à 6 fois à 60 degrés pendant 1 heure est appelée tyndalisation.
De nombreux dispositifs médicaux constitués de matériaux polymères ne peuvent pas supporter la stérilisation à la vapeur selon les modes conventionnels. Pour de nombreux produits, en raison des particularités des liquides qu'ils contiennent (conservateurs, médicaments et autres agents), il est impossible de stériliser par les méthodes et méthodes conventionnelles. Pour de tels produits, des modes de stérilisation individuels sont développés pour assurer un approvisionnement fiable en objets.
Ainsi, la stérilisation du rotor pour séparer le sang en fractions est effectuée avec de la vapeur d'eau à une température de 120 degrés pendant 45 minutes.
La stérilité des contenants pour les conservateurs est obtenue à 110 degrés pendant 60 minutes.
L'ébullition est une méthode de stérilisation utilisée pour sécuriser les seringues réutilisables, Instruments chirurgicaux, tubes en caoutchouc, plats en verre et en métal.
La stérilisation par ébullition est réalisée dans des stérilisateurs. Les formes de spores meurent dans l'eau bouillante après 20 à 30 minutes. L'ébullition pendant 45 minutes est largement utilisée pour décontaminer les sécrétions et autres matières infectieuses, le linge, la vaisselle, les jouets et les articles de soins aux patients.
Eau chaude (60 - 100 degrés) avec détergents utilisé pour le lavage et le nettoyage pour l'élimination mécanique de la saleté et des micro-organismes.
La plupart des cellules végétatives meurent à 70 degrés après 30 minutes.
La stérilisation par filtration est utilisée dans les cas où les substrats ne supportent pas le chauffage, notamment pour les milieux contenant des protéines, pour les sérums, certains antibiotiques, vitamines, substances volatiles. Cette technique est assez largement utilisée pour stériliser le fluide de culture, lorsqu'il est nécessaire de le débarrasser des cellules des micro-organismes, mais en gardant inchangés tous les produits métaboliques qu'il contient.
La méthode consiste à filtrer les liquides à travers des filtres spéciaux à cloisons finement poreuses et donc à retenir les cellules des micro-organismes.
Deux types de filtres sont les plus couramment utilisés : les filtres à membrane et les filtres Seitz.
Les filtres à membrane sont fabriqués à partir de collodion, d'acétate, de cellulose et d'autres matériaux.
Les filtres Seitz sont fabriqués à partir d'un mélange d'amiante et de cellulose.
De plus, pour la stérilisation, on utilise des filtres constitués de kaolin mélangé à du sable de quartz, de terre à infusion et d'autres matériaux ("bougies" de Chamberlan, Berkfeld).
Les filtres à membrane et à amiante sont conçus pour un usage unique.
Sous irradiation ultraviolette, l'effet bactéricide est assuré par des rayons d'une longueur de 200 à 450 nm, dont la source est des lampes bactéricides.
À l'aide de lampes bactéricides, la stérilisation est effectuée aux rayons ultraviolets de l'air dans les établissements médicaux et prophylactiques, les boîtes de laboratoires microbiologiques, dans les entreprises de l'industrie alimentaire, dans les boîtes pour la production de vaccins et de sérums, dans les salles d'opération, les manipulations, les institutions pour enfants , etc.
Les rayons ultraviolets ont une activité antimicrobienne élevée et peuvent provoquer la mort non seulement des cellules végétatives, mais aussi de leurs spores.
La lumière du soleil provoque la mort des micro-organismes sous l'action des rayons ultraviolets et du séchage.
Le séchage à la lumière du soleil a un effet néfaste sur de nombreux types de micro-organismes, mais son effet est superficiel et donc la lumière du soleil joue un rôle auxiliaire dans la pratique de la stérilisation.
Récemment, dans le traitement des plaies et des brûlures, des revêtements en polymères synthétiques et naturels ont été utilisés sous forme de gels.
Les films antiseptiques polymériques sont largement utilisés pour le traitement local des plaies et des brûlures. Ils comprennent des agents antimicrobiens à large spectre tels que le catapol, la dioxidine, l'iode bleu et le sorbitol contenant du glutaraldéhyde. Pour stériliser ces films, des rayonnements ionisants sont utilisés à une dose de 20,0 kGy. Avec la production industrielle de films polymériques antiseptiques et absorbants, leur stérilité dans ce mode de stérilisation est pleinement assurée.
Le rayonnement radioactif tue tous les types de micro-organismes à la fois sous forme végétative et sous forme de spores. Il est largement utilisé pour la stérilisation dans les entreprises produisant des produits stériles et des produits médicaux stériles à usage unique, pour la désinfection des eaux usées et des matières premières d'origine animale.
Méthode de stérilisation mécanique
Les méthodes de stérilisation mécanique éliminent les germes de la surface des objets. Ceux-ci comprennent le lavage, le secouage, le balayage, l'essuyage humide, la ventilation, la ventilation, l'aspiration et le lavage.
Méthode de stérilisation chimique
Dans la pratique médicale, les plastiques sont maintenant de plus en plus utilisés.
Ils sont utilisés en dentisterie, chirurgie maxillo-faciale, traumatologie, orthopédie, chirurgie. La plupart des plastiques ne résistent pas à la stérilisation à la vapeur sous pression thermique et à la chaleur sèche (air sec chauffé). Les solutions d'alcool, de diocide, de solution ternaire utilisées pour stériliser de tels objets n'assurent pas la stérilité des produits transformés.
Par conséquent, des méthodes de gaz et de rayonnement, ainsi que des solutions de préparations chimiques, sont utilisées pour stériliser les produits en plastique.
L'introduction dans la pratique des établissements médicaux d'un grand nombre de produits en matériaux thermolabiles contribue à l'introduction de rayonnements, voies de gaz désinfection et stérilisation avec des solutions de désinfectants.
En stérilisation chimique, on utilise des gaz et des agents de divers groupes chimiques (peroxydes, phénoliques, halogénés, aldéhydes, alcalis et acides, tensioactifs, etc.). Pour un usage domestique, des détergents, des nettoyants, des blanchissants et d'autres préparations sont produits qui ont un effet antimicrobien en raison de l'introduction de divers produits chimiques dans leur composition.
Ces préparations sont utilisées pour nettoyer et désinfecter le matériel sanitaire, la vaisselle, le linge, etc.
La vapeur de formaldéhyde (sous forme de vapeur) peut être utilisée dans les hôpitaux pour la stérilisation de produits médicaux métalliques (scalpels, aiguilles, pincettes, sondes, pinces, crochets, coupe-fil, etc.).
Avant la stérilisation à la vapeur de formaldéhyde, les produits doivent être pré-stérilisés et soigneusement séchés.
Lorsqu'il est stérilisé par n'importe quel chimiquement la procédure de traitement d'un objet dépend des caractéristiques de l'objet à désinfecter, de la résistance des microbes, des caractéristiques des propriétés de la préparation chimique, de la température ambiante, de l'humidité et d'autres facteurs.
Ainsi, la stérilité des instruments métalliques est obtenue en cinq heures de maintien dans une enceinte étanche avec une vapeur à une température d'au moins 20 degrés et humidité relative 95 - 98%, à une température de 15 degrés, la stérilité complète de ces objets n'est atteinte qu'après 16 heures.
L'activité sporicide du glutaraldéhyde dépend de la température. L'optimum de son action se produit à une température de 15 à 25 degrés. Avec une augmentation de la température, l'activité de l'action sporicide de ce médicament diminue.
La stérilisation chimique est utilisée de manière quelque peu limitée. Le plus souvent, cette méthode est utilisée pour éviter la contamination bactérienne des milieux de culture et des préparations immunobiologiques (vaccins et sérums). Des substances telles que le chloroforme, le toluène et l'éther sont le plus souvent ajoutées aux milieux nutritifs. S'il est nécessaire de libérer le milieu de ces conservateurs, il est chauffé au bain-marie à 56 degrés et les conservateurs s'évaporent.
Pour la conservation des vaccins ou des sérums, on utilise du merthiolate, de l'acide borique, du formol.
Méthode de stérilisation biologique
La stérilisation biologique est basée sur l'utilisation d'antibiotiques.
Cette méthode est largement utilisée dans la culture de virus.
La stérilisation (du latin sterilis - stérile) implique l'inactivation complète des microbes sur les objets en cours de traitement.
Four Pasteur - Stérilisation à chaleur sèche.
Il existe trois méthodes principales de stérilisation : la chaleur, les radiations, les produits chimiques.
Iode.
La stérilisation thermique est basée sur la sensibilité des microbes à la chaleur.
À 60 ° C et en présence d'eau, il se produit une dénaturation des protéines, y compris des enzymes, à la suite de laquelle les formes végétatives des microbes meurent. Les spores contenant une très faible quantité d'eau à l'état lié et possédant des membranes denses sont inactivées à 160-170°C. Pour la stérilisation thermique, on utilise principalement de la chaleur sèche et de la vapeur sous pression.
La stérilisation à la chaleur sèche est réalisée dans des étuves sèches, ou étuves Pasteur. Le four Pasteur est une armoire métallique hermétique, chauffée à l'électricité et équipée d'un thermomètre.
La désinfection du matériel qu'il contient se produit à 160-170 ° C pendant 60-120 minutes. L'inconvénient de cette méthode est que seuls certains articles stérilisés, comme le verre de laboratoire, peuvent résister à une température aussi élevée.
La méthode de stérilisation la plus polyvalente est le traitement à la vapeur sous pression en autoclave, dans lequel les pansements, le linge, de nombreux instruments, les milieux de culture, les solutions, le matériel infectieux, etc. sont stérilisés.
Un autoclave est un cylindre métallique à parois solides, hermétiquement fermé, composé d'une chambre à vapeur et de chambres de stérilisation. L'appareil est équipé d'un manomètre, d'un thermomètre et d'autres dispositifs de surveillance. Une pression accrue est créée dans l'autoclave, ce qui entraîne une augmentation du point d'ébullition de l'eau. Ainsi, à 0,5 atm, le point d'ébullition est de 80 ° , à 1 atm - 100 ° , à 2 atm - 121 ° et à 3 atm - 136 ° .
Du fait qu'en plus de la température élevée, la vapeur agit sur les micro-organismes, les spores meurent déjà à 120 ° C. Le mode de fonctionnement le plus courant pour un autoclave est 2 atm, 121°C, 15-20 minutes. Le temps de stérilisation diminue avec l'augmentation de la pression atmosphérique et, par conséquent, le point d'ébullition. Les micro-organismes meurent en quelques secondes, mais le matériau est traité plus longtemps, car, d'une part, il doit y avoir une température élevée à l'intérieur du matériau à stériliser et, d'autre part, il existe un champ dit de sécurité, conçu pour un écart possible par rapport aux paramètres spécifiés lors du fonctionnement de l'autoclave.
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La vie des micro-organismes dépend étroitement des conditions environnementales. Tous les facteurs environnementaux affectant les micro-organismes peuvent être divisés en trois groupes : physiques, chimiques et biologiques, dont l'effet bénéfique ou néfaste dépend à la fois de la nature du facteur lui-même et des propriétés du micro-organisme.
Facteurs physiques
Parmi les facteurs physiques, la plus grande influence sur le développement des micro-organismes est exercée par la température, le séchage, l'énergie rayonnante et les ultrasons.
Température... L'activité vitale de chaque micro-organisme est limitée par certaines limites de température. Cette dépendance à la température s'exprime généralement par trois points principaux : minimum - la température en dessous de laquelle la reproduction des cellules microbiennes s'arrête ; optimal - la meilleure température pour la croissance et le développement des micro-organismes; maximum - la température au-dessus de laquelle l'activité vitale des cellules est affaiblie ou arrêtée. La température optimale correspond généralement aux conditions de température de l'habitat naturel.
Tous les micro-organismes en relation avec la température sont subdivisés en psychrophiles, mésophiles et thermophiles.
Les psychrophiles (du grec psychros - froid, phileo - j'aime), ou micro-organismes qui aiment le froid, se développent avec une basses températures ah: la température minimale est de 0 ° C, la température optimale est de 10 à 20 ° C, la température maximale de 30 ° C. Ce groupe comprend les micro-organismes qui vivent dans les mers et océans du nord, le sol et les eaux usées. Cela inclut également les bactéries lumineuses et ferreuses, ainsi que les microbes qui provoquent la détérioration des aliments par temps froid (en dessous de 0 ° C).
Les mésophiles (du grec mesos - milieu) constituent le groupe le plus étendu, comprenant la plupart des saprophytes et tous les micro-organismes pathogènes. La température optimale pour eux est de 28-37 ° C, le minimum est de 10 ° C, le maximum est de 45 ° C.
Les thermophiles (du grec termos - chaleur, chaleur), ou micro-organismes thermophiles, se développent à des températures supérieures à 55 ° C, la température minimale pour eux est de 30 ° C, l'optimum est de 50-60 ° C et le maximum est de 70-75 °C. On les trouve dans les sources minérales chaudes, la couche superficielle du sol, les substrats auto-échauffants (fumier, foin, céréales), les intestins des humains et des animaux. Il existe de nombreuses formes de spores parmi les thermophiles.
Les températures élevées et basses ont des effets différents sur les micro-organismes. Certains sont plus sensibles aux températures élevées. De plus, plus la température en dehors du maximum est élevée, plus la mort des cellules microbiennes est rapide, ce qui est dû à la dénaturation (coagulation) des protéines cellulaires.
Les formes végétatives de bactéries mésophiles meurent à une température de 60 ° C dans les 30 à 60 minutes et à 80 à 100 ° C - après 1 à 2 minutes. Les spores bactériennes sont beaucoup plus résistantes aux températures élevées. Par exemple, les spores de bacilles charbonneuses peuvent résister à l'ébullition pendant 10 à 20 minutes et les spores de botulisme Clostridium - heures 6. Tous les micro-organismes, y compris les spores, meurent à 165-170 ° C en une heure (dans une armoire à chaleur sèche) ou lorsque exposé à de la vapeur sous pression de 1 atm (en autoclave) pendant 30 min.
L'action des températures élevées sur les micro-organismes est à la base de la stérilisation - la libération complète de divers objets des micro-organismes et de leurs spores (voir ci-dessous).
De nombreux micro-organismes sont extrêmement résistants aux basses températures. Typhus salmonella et Vibrio cholerae survivent longtemps dans la glace. Certains micro-organismes restent viables à des températures de l'air liquide (-190°C), et les spores bactériennes peuvent supporter des températures allant jusqu'à -250°C.
Seuls certains types de bactéries pathogènes sont sensibles aux basses températures (par exemple, Bordetella pertussis et para-pertussis, Neisseria meningococcus, etc.). Ces propriétés des micro-organismes sont prises en compte dans les diagnostics de laboratoire et lors du transport du matériel de test - il est livré au laboratoire à l'abri du refroidissement.
L'action des basses températures suspend les processus de putréfaction et de fermentation, ce qui est largement utilisé pour conserver produits alimentaires dans des unités de réfrigération, des caves, des glaciers. À des températures inférieures à 0 ° C, les microbes tombent dans un état d'animation suspendue - les processus métaboliques ralentissent et la reproduction s'arrête. Cependant, en présence de conditions de température appropriées et d'un milieu nutritif, les fonctions vitales des cellules microbiennes sont restaurées. Cette propriété des micro-organismes est utilisée en laboratoire pour conserver les cultures microbiennes à basse température. Un changement rapide des températures élevées et basses (congélation et décongélation) a également un effet néfaste sur les micro-organismes - cela conduit à la rupture des membranes cellulaires.
Séchage... Pour le fonctionnement normal des micro-organismes, l'eau est nécessaire. Le séchage entraîne une déshydratation du cytoplasme, une perturbation de l'intégrité de la membrane cytoplasmique, ce qui perturbe la nutrition des cellules microbiennes et entraîne leur mort.
Date limite de dépérissement différents types les micro-organismes sous l'influence du séchage sont significativement différents. Ainsi, par exemple, les Neisseria pathogènes (méningocoques, gonocoques), leptospira, treponema pallidum et autres meurent en séchant après quelques minutes. Vibrio cholerae peut résister au séchage pendant 2 jours, Typhus Salmonella - 70 jours et Mycobacterium tuberculosis - 90 jours. Mais les crachats séchés des patients tuberculeux, dans lesquels les agents pathogènes sont protégés par une gaine protéique sèche, restent infectieux pendant 10 mois.
Les spores sont particulièrement résistantes au séchage, ainsi qu'à d'autres influences environnementales. Les spores des bacilles du charbon conservent la capacité de germer pendant 10 ans et les spores de moisissures - jusqu'à 20 ans.
L'effet défavorable du séchage sur les micro-organismes a longtemps été utilisé pour la conservation des légumes, des fruits, de la viande, du poisson et des herbes médicinales. Dans le même temps, une fois dans des conditions d'humidité élevée, ces produits se détériorent rapidement en raison de la restauration de l'activité vitale des microbes.
Pour le stockage de cultures de micro-organismes, de vaccins et d'autres préparations biologiques, la méthode de lyophilisation est largement utilisée. L'essence de la méthode réside dans le fait que les micro-organismes ou les préparations sont préalablement soumis à une congélation, puis ils sont séchés sous vide. Dans ce cas, les cellules microbiennes entrent dans un état d'animation suspendue et conservent leurs propriétés biologiques pendant plusieurs mois ou années.
Energie radiante... Dans la nature, les micro-organismes sont constamment exposés au rayonnement solaire. La lumière directe du soleil provoque la mort de nombreux micro-organismes en quelques heures, à l'exception des bactéries photosynthétiques (bactéries soufrées vertes et violettes). L'effet destructeur de la lumière du soleil est dû à l'activité des rayons ultraviolets (rayons UV). Ils inactivent les enzymes cellulaires et endommagent l'ADN. Les bactéries pathogènes sont plus sensibles aux rayons UV que les saprophytes. Par conséquent, il est préférable de stocker les cultures microbiennes en laboratoire dans l'obscurité. L'expérience de Buchner est démonstrative à cet égard.
Dans une boîte de Pétri avec une fine couche de gélose, une inoculation abondante de toute culture de bactéries est effectuée. A l'extérieur de la coupelle ensemencée, des lettres découpées dans du papier noir sont collées pour former, par exemple, le mot « typhus ». La coupelle, retournée, est irradiée en lumière solaire directe pendant 1 heure, puis les papiers sont retirés et la coupelle est placée dans un thermostat à 37°C pendant une journée. Le reste de la gélose reste transparent, c'est-à-dire que la croissance des micro-organismes est absente (Fig. 11).
L'importance de la lumière du soleil comme facteur naturel d'amélioration de l'environnement extérieur est grande. Il libère l'air, l'eau « des réservoirs naturels, les couches supérieures du sol des bactéries pathogènes ».
L'effet bactéricide (destructeur des bactéries) des rayons UV est utilisé pour stériliser l'air intérieur (blocs opératoires, vestiaires, box…), ainsi que l'eau et le lait. Les sources de ces rayons sont les lampes ultraviolettes, les lampes germicides.
D'autres types d'énergie rayonnante - les rayons X, les rayons α-, -, γ n'ont un effet destructeur sur les micro-organismes qu'à fortes doses, de l'ordre de 440-280 J / kg. La mort des microbes est due à la destruction des structures nucléaires et de l'ADN cellulaire. De petites doses de rayonnement stimulent la croissance des cellules microbiennes. Les micro-organismes sont beaucoup plus résistants aux rayonnements radioactifs que les organismes supérieurs. On sait que les bactéries thioniques vivent dans les gisements de minerai d'uranium. Des bactéries ont été trouvées dans l'eau des réacteurs nucléaires à une concentration de rayonnement ionisant de 20-30 kJ/kg.
L'effet bactéricide des rayonnements ionisants est utilisé pour la conservation de certains produits alimentaires, la stérilisation de préparations biologiques (sérums, vaccins, etc.), alors que les propriétés du matériel stérilisé ne changent pas.
V dernières années la méthode par rayonnement est utilisée pour stériliser les produits jetables - pipettes en polystyrène, boîtes de Pétri, puits pour réactions sérologiques, seringues, ainsi que matériel de suture - catgut, etc.
Ultrason provoque des dommages importants à la cellule microbienne. Sous l'action des ultrasons, les gaz du milieu liquide du cytoplasme sont activés, et un haute pression(jusqu'à 10 000 atm). Cela conduit à la rupture de la membrane cellulaire et à la mort cellulaire. L'échographie est utilisée pour stériliser les aliments (lait, jus de fruits), l'eau potable.
Haute pression... Les bactéries et surtout leurs spores résistent à la pression mécanique. Dans la nature, il existe des bactéries qui vivent dans les mers et les océans à une profondeur de 1000 à 10000 m sous des pressions de 100 à 900 atm. Certains types de bactéries peuvent résister à des pressions allant jusqu'à 3000-5000 atm, et des spores bactériennes - même 20 000 atm.
Facteurs chimiques
L'effet des produits chimiques sur les micro-organismes est différent selon la nature du composé chimique, sa concentration, la durée d'exposition aux cellules microbiennes. Selon la concentration, un produit chimique peut être une source de nourriture ou avoir un effet dépressif sur l'activité vitale des micro-organismes. Par exemple, une solution de glucose à 0,5-2% stimule la croissance des microbes, et les solutions de glucose à 20-40% retardent la multiplication des cellules microbiennes.
Beaucoup composants chimiques, qui ont un effet néfaste sur les micro-organismes, sont utilisés dans la pratique médicale comme désinfectants et antiseptiques.
Les produits chimiques utilisés pour la désinfection sont appelés désinfectants. La désinfection est comprise comme des mesures visant à détruire les micro-organismes pathogènes dans divers objets environnementaux. Les désinfectants comprennent les composés galliques, les phénols et leurs dérivés, les sels métaux lourds, certains acides, alcalis, alcools, etc. Ils provoquent la mort des cellules microbiennes, agissant à des concentrations optimales pendant un certain temps. De nombreux désinfectants ont un effet nocif sur les tissus du macro-organisme.
Les antiseptiques sont des produits chimiques qui peuvent tuer les micro-organismes ou inhiber leur croissance et leur reproduction. Ils sont utilisés avec but thérapeutique(chimiothérapie), ainsi que pour la désinfection des plaies, de la peau, des muqueuses d'une personne. Les propriétés antiseptiques sont possédées par le peroxyde d'hydrogène, les solutions alcooliques d'iode, de vert brillant, les solutions de permanganate de potassium, etc. Certaines substances antiseptiques (acides acétique, sulfureux, benzoïque, etc.) à des doses inoffensives pour l'homme sont utilisées pour la conservation des aliments.
Selon le mécanisme d'action, les produits chimiques ayant une activité antimicrobienne peuvent être divisés en plusieurs groupes.
1. Les tensioactifs (acides gras, savons et autres détergents) provoquent une diminution de la tension superficielle, ce qui entraîne une perturbation du fonctionnement de la paroi cellulaire et de la membrane cytoplasmique des micro-organismes.
2. Le phénol, le crésol et leurs dérivés provoquent la coagulation des protéines microbiennes. Ils sont utilisés pour désinfecter le matériel infectieux dans la pratique microbiologique et les hôpitaux de maladies infectieuses.
3. Les oxydants, interagissant avec les protéines microbiennes, perturbent l'activité des enzymes, provoquent la dénaturation des protéines. Le chlore et l'ozone sont des oxydants actifs, qui sont utilisés pour désinfecter l'eau potable. Les dérivés du chlore (eau de Javel, chloramine) sont largement utilisés à des fins de désinfection. Le peroxyde d'hydrogène, le permanganate de potassium, l'iode, etc. ont des propriétés oxydantes.
4. Le formaldéhyde est utilisé comme solution à 40 % (formol) pour la désinfection. Il tue les formes végétatives et sporulées des micro-organismes. Le formol bloque les groupes aminés des protéines cellulaires microbiennes et provoque leur dénaturation.
5. Les sels de métaux lourds (mercure, plomb, zinc, or, etc.) coagulent les protéines de la cellule microbienne, provoquant ainsi leur mort. Un certain nombre de métaux (argent, or, mercure, etc.) ont un effet bactéricide sur les microorganismes à des concentrations négligeables. Cette propriété est appelée action oligodynamique (du latin oligos - petit, dinamys - force). Il a été prouvé que l'eau dans les récipients en argent ne pourrit pas en raison de l'action bactéricide des ions d'argent. Pour la prévention de la blénorrhée* chez le nouveau-né pendant longtemps utilisé une solution à 1% de nitrate d'argent. Des solutions colloïdales de composés organiques d'argent (protargol, collargol) sont également utilisées sous forme d'agents antiseptiques locaux.
* (La blénorrhée est une inflammation de la conjonctive de l'œil causée par les gonocoques.)
Les préparations de mercure ont un fort effet antimicrobien. Pendant longtemps, le bichlorure de mercure, ou chlorure mercurique (à une dilution de 1: 1000) a été utilisé pour la désinfection. Cependant, il a un effet toxique sur les tissus du macro-organisme et son utilisation est limitée.
6. Les colorants (vert brillant, rivanol, etc.) ont la capacité d'inhiber la croissance des bactéries. Des solutions d'un certain nombre de colorants sont utilisées comme agents antiseptiques et sont également introduites dans la composition de certains milieux nutritifs pour inhiber la croissance de la microflore associée.
L'effet destructeur d'un certain nombre de facteurs physiques et chimiques sur les micro-organismes constitue la base des méthodes aseptiques et antiseptiques largement utilisées dans la pratique médicale et sanitaire.
L'asepsie est un système de mesures préventives permettant d'éviter la contamination microbienne d'un objet (plaies, champ opératoire, cultures de micro-organismes, etc.), basé sur des méthodes physiques.
Les antiseptiques sont un ensemble de mesures visant à détruire les micro-organismes d'une plaie, de tout le corps ou sur des objets de l'environnement extérieur, à l'aide de divers produits chimiques désinfectants.
Facteurs biologiques
Dans l'habitat naturel, les micro-organismes n'existent pas isolément, mais sont dans des relations complexes, qui se réduisent principalement à la symbiose, la métabiose et l'antagonisme.
La symbiose est la cohabitation de différentes espèces d'organismes qui leur apportent un bénéfice mutuel. En même temps, ils se développent mieux ensemble que chacun d'eux séparément.
Des relations symbiotiques existent entre les bactéries nodulaires et les légumineuses, entre les champignons filamenteux et les algues bleu-vert (lichens) : La symbiose des bactéries lactiques et de la levure alcoolique permet de préparer certains produits lactiques (kéfir, koumiss).
La métabiose est un type de relation dans lequel les produits métaboliques d'un type de micro-organisme créent les conditions nécessaires pour le développement des autres. Par exemple, les micro-organismes putréfiants qui décomposent les substances protéiques contribuent à l'accumulation de composés d'ammonium dans l'environnement et créent des conditions favorables à la croissance et au développement des bactéries nitrifiantes. Et le développement des anaérobies dans un sol bien aéré serait impossible sans les aérobies qui absorbent l'oxygène libre.
Les relations métabiotiques sont répandues parmi les micro-organismes du sol et sous-tendent le cycle des substances dans la nature.
L'antagonisme est une forme de relation dans laquelle un micro-organisme inhibe le développement d'un autre ou peut provoquer sa mort complète. Des relations antagonistes se sont développées chez les micro-organismes dans la lutte pour l'existence. Partout où ils vivent, il y a une lutte continue entre eux pour les sources de nourriture, l'oxygène de l'air et l'habitat. Ainsi, la majorité des bactéries pathogènes, ayant pénétré avec les sécrétions des patients en environnement externe(sol, eau), ne résistent pas ici à la compétition à long terme avec de nombreux saprophytes et meurent relativement vite.
L'antagonisme peut être dû à l'action directe des micro-organismes les uns sur les autres ou à l'action de leurs produits métaboliques. Par exemple, les protozoaires dévorent les bactéries et les phages les lysent. Les intestins des nouveau-nés sont habités par la bactérie lactique Bifidobacterium bifidum. En libérant de l'acide lactique, ils suppriment la croissance des bactéries putréfiantes et protègent ainsi l'organisme encore instable des nourrissons des troubles intestinaux. Certains micro-organismes dans le processus de la vie produisent diverses substances qui ont un effet néfaste sur les bactéries et autres microbes. Ces substances comprennent des antibiotiques (voir « Antibiotiques »).
Questions de contrôle
1. Quels facteurs physiques influencent l'activité vitale des micro-organismes ?
2. Quelles substances sont classées comme désinfectants et en quoi diffèrent-elles dans le mécanisme d'action sur les micro-organismes ?
3. Énumérez les relations qui existent entre les micro-organismes ?
Stérilisation
La stérilisation est l'épuisement, c'est-à-dire la libération complète des objets environnementaux des micro-organismes et de leurs spores.
La stérilisation s'effectue de différentes manières :
1) physique (exposition à des températures élevées, rayons UV, utilisation de filtres bactériens) ;
2) chimique (utilisation de divers désinfectants, antiseptiques);
3) biologique (utilisation d'antibiotiques).
Dans la pratique en laboratoire, des méthodes physiques de stérilisation sont généralement utilisées.
La possibilité et l'opportunité d'utiliser l'une ou l'autre méthode de stérilisation sont dues aux caractéristiques du matériau à stériliser, à ses propriétés physiques et chimiques.
Méthodes physiques
La calcination dans la flamme d'un brûleur ou d'un flambage est une méthode de stérilisation dans laquelle l'objet est complètement épuisé, car les cellules végétatives et les spores de micro-organismes meurent. Habituellement, les boucles bactériologiques, les spatules, les pipettes, les lames de microscope et de couverture et les petits instruments sont calcinés. Les ciseaux et scalpels ne doivent pas être stérilisés par calcination, car la surface de coupe s'émousse sous l'influence du feu.
Stérilisation à la chaleur sèche
La stérilisation à la chaleur sèche ou à l'air chaud est réalisée dans des étuves Pasteur (étuves de séchage). Le poêle Pasteur est une armoire à double paroi faite de matériaux résistants à la chaleur - métal et amiante. L'armoire est chauffée à l'aide de brûleurs à gaz ou de radiateurs électriques. Les armoires chauffées électriquement sont équipées de régulateurs pour assurer la température requise. Pour contrôler la température, un thermomètre est inséré dans le trou de la paroi supérieure de l'armoire.
La verrerie de laboratoire est principalement stérilisée par chaleur sèche. Les plats préparés pour la stérilisation ne sont pas chargés de manière serrée dans le four pour assurer un chauffage uniforme et fiable du matériel à stériliser. La porte de l'armoire est bien fermée, le dispositif de chauffage est allumé, la température est portée à 160-165° C et à cette température, elle est stérilisée pendant 1 heure.À la fin de la stérilisation, le chauffage est éteint, mais l'armoire la porte n'est pas ouverte tant que le four n'a pas refroidi ; sinon, l'air froid pénétrant dans l'armoire peut provoquer des fissures dans les plats chauds.
La stérilisation en étuve Pasteur peut être réalisée à différentes conditions de température et d'exposition (temps de stérilisation) (tableau 1).
Les liquides (milieux de culture, solution isotonique de chlorure de sodium, etc.), les objets en caoutchouc et en matières synthétiques ne peuvent pas être stérilisés à la chaleur sèche, car les liquides bout et se déversent, et le caoutchouc et les matières synthétiques fondent.
Pour contrôler la stérilisation dans un four Pasteur, des fils de soie sont humidifiés dans une culture de bactéries sporulées, séchés, placés dans une boîte de Pétri stérile et placés dans un four Pasteur. La stérilisation est réalisée à une température de 165°C pendant 1 heure (pour le contrôle, une partie des fils est laissée à température ambiante). Puis les fils stérilisés et témoins sont placés à la surface de la gélose dans une boîte de Pétri ou placés dans des tubes avec du bouillon et incubés dans un thermostat à 37°C pendant 2 jours. Avec le bon fonctionnement de l'étuve Pasteur, il n'y aura pas de croissance dans les tubes à essai ou les coupelles avec des milieux de culture, où les fils stérilisés ont été placés, car les spores bactériennes mourront, tandis que les spores bactériennes sur les fils qui n'ont pas été stérilisés (contrôle) germera sur les milieux de culture, la croissance sera notée.
Pour déterminer la température à l'intérieur du four Pasteur, vous pouvez utiliser du saccharose ou du sucre cristallisé alimentaire, caramélisé à une température de 165-170°C.
Préparation de la verrerie de laboratoire pour la stérilisation en étuve Pasteur... Avant stérilisation, la verrerie de laboratoire (boîtes de Pétri, pipettes graduées et Pasteur, flacons, flacons, éprouvettes) doit être soigneusement lavée, séchée et emballée dans du papier, faute de quoi, après stérilisation, elle peut à nouveau être contaminée par les bactéries de l'air.
Les boîtes de Pétri sont emballées dans du papier en un ou plusieurs morceaux ou placées dans des caisses métalliques spéciales.
Des cotons-tiges sont insérés dans les extrémités supérieures des pipettes pour empêcher le matériau de test d'entrer dans la bouche. Les pipettes graduées sont enveloppées dans de longues bandes de papier de 4 à 5 cm de large.Le volume de la pipette enveloppée est marqué sur le papier. Dans les étuis à crayons, les pipettes graduées sont stérilisées sans emballage papier supplémentaire.
Noter... Si la graduation sur les pipettes est peu visible, elle est restaurée avant la stérilisation. Appliquer à la pipette peinture à l'huile et, sans laisser sécher la peinture, frottez-y la poudre de sulfate de baryum avec un chiffon. Après cela, retirez l'excès de peinture avec un chiffon, qui ne reste que dans les encoches de graduation. Les pipettes ainsi traitées doivent être rincées.
Les extrémités pointues des pipettes Pasteur sont scellées dans une flamme de brûleur et enveloppées dans du papier, 3 à 5 pièces chacune. Il est nécessaire d'emballer soigneusement les pipettes Pasteur afin de ne pas casser les extrémités scellées des capillaires.
Les flacons, flacons, tubes à essai sont fermés avec des bouchons en gaze de coton. Le bouchon doit s'insérer dans le col du récipient sur les 2/3 de sa longueur, pas trop serré, mais pas lâche non plus. Au-dessus des bouchons, un bouchon en papier est mis sur chaque récipient (sauf pour les tubes à essai). Les tubes sont attachés en 5 à 50 morceaux et enveloppés dans du papier.
Noter... À haute température, le papier dans lequel sont enveloppés les gobelets et les pipettes et le coton jaunissent et peuvent même carboniser, de sorte que chaque nouvelle variété les papiers produits en laboratoire doivent être testés aux conditions de température acceptées.
Questions de contrôle
1. Que signifie le terme stérilisation ?
2. Quelles méthodes sont utilisées pour la stérilisation ?
3. Qu'est-ce qui est stérilisé par calcination au feu ?
4. Décrire le dispositif et le mode de fonctionnement du four Pasteur.
5. Qu'est-ce qui est stérilisé dans un four Pasteur ?
6. Comment la verrerie est-elle préparée pour la stérilisation ?
7. Pourquoi les milieux de culture et les objets en caoutchouc ne peuvent-ils pas être stérilisés dans un four Pasteur ?
Exercer
Préparez des boîtes de Pétri, des pipettes graduées, des pipettes Pasteur, des tubes à essai, des flacons et des flacons pour la stérilisation.
Faire bouillir la stérilisation
L'ébullition est une méthode de stérilisation, qui garantit qu'il n'y a pas de spores dans le matériel à stériliser. Ils sont utilisés pour traiter des seringues d'instruments, des ustensiles en verre et en métal, des tubes en caoutchouc, etc.
La stérilisation par ébullition est généralement effectuée dans un stérilisateur - une boîte métallique rectangulaire avec un couvercle hermétique. Le matériel à stériliser est placé sur une grille dans le stérilisateur et rempli d'eau. Pour augmenter le point d'ébullition et éliminer la dureté de l'eau, ajoutez 1-2% de bicarbonate de sodium (il est préférable d'utiliser de l'eau distillée). Le stérilisateur est fermé avec un couvercle et chauffé.Le début de la stérilisation est considéré comme le moment de l'ébullition de l'eau, le temps d'ébullition est de 15-30 minutes. À la fin de la stérilisation, le maillage avec les instruments est retiré par les poignées latérales avec des crochets spéciaux, et les instruments qu'il contient sont pris avec une pince à épiler ou une pince stérile, qui sont bouillis avec le reste des instruments.
La stérilisation à la vapeur s'effectue de deux manières : 1) vapeur sous pression ; 2) vapeur qui coule.
Stérilisation à la vapeur sous pression produit en autoclave. Cette méthode de stérilisation est basée sur l'exposition des matériaux à stériliser à de la vapeur d'eau saturée à une pression supérieure à la pression atmosphérique. À la suite d'une telle stérilisation, avec un seul traitement, les formes végétatives et sporulées des micro-organismes meurent.
Autoclave (Fig. 12) - une chaudière massive, recouverte à l'extérieur d'un boîtier métallique, hermétiquement scellée par un couvercle, qui est fermement vissée à la chaudière avec des boulons à charnière. Un autre diamètre plus petit est inséré dans le chaudron extérieur, appelé chambre de stérilisation. Les articles à stériliser sont placés dans cette chambre. Il y a un espace libre entre les deux chaudières, appelé chambre à vapeur d'eau. L'eau est versée dans cette chambre à travers un entonnoir, renforcé de l'extérieur, jusqu'à un certain niveau, marqué sur un compteur d'eau spécial. Lorsque l'eau est bouillie dans la chambre à vapeur, de la vapeur se forme. La chambre de stérilisation est équipée d'une vanne de sortie avec une soupape de sécurité pour évacuer la vapeur lorsque la pression monte au-dessus de la valeur requise. Un manomètre est utilisé pour déterminer la pression générée dans la chambre de stérilisation.
Riz. 12. Schéma de l'autoclave. M - manomètre ; PC - soupape de sécurité ; B - entonnoir pour l'eau; K 2 - robinet pour sortie d'eau; K 3 - un robinet pour l'évacuation de la vapeur
La pression atmosphérique normale (760 mm Hg) est considérée comme nulle. Il existe une relation définie entre les lectures du manomètre et la température (tableau 2).
Actuellement, il existe des autoclaves avec régulation automatique du mode de fonctionnement. En plus du manomètre habituel, ils sont équipés d'un manomètre à contact électrique, qui empêche la pression d'augmenter au-dessus d'une valeur prédéterminée et assure ainsi la constance de la température requise dans l'autoclave.
Divers milieux nutritifs (sauf ceux contenant des protéines natives), liquides (solution isotonique de chlorure de sodium, eau, etc.) sont stérilisés à la vapeur sous pression ; appareils électroménagers, en particulier ceux avec des pièces en caoutchouc.
La température et la durée d'autoclavage des milieux de culture sont déterminées par leur composition, indiquée dans la recette de préparation du milieu de culture. Par exemple, des milieux simples (gélose mésopatamique, bouillon mésopatamie) sont stérilisés 20 minutes à 120°C (1 atm). Cependant, à cette température, il est impossible de stériliser des milieux contenant des protéines natives, des glucides et d'autres substances qui sont facilement modifiées par chauffage. Les milieux contenant des glucides sont stérilisés de manière fractionnée à 100°C ou en autoclave à 112°C (0,5 atm) pendant 10-15 minutes. Divers liquides, appareils avec tuyaux en caoutchouc, bouchons, bougies bactériennes et filtres sont stérilisés pendant 20 minutes à 120°C (1 atm).
Attention! Dans les autoclaves, ils neutralisent également le matériel infecté. Les coupelles et les tubes à essai contenant des cultures de micro-organismes sont placés dans des seaux ou des réservoirs métalliques spéciaux avec des trous dans le couvercle pour la pénétration de la vapeur et stérilisés dans un autoclave à 126 ° C (1,5 atm) pendant 1 heure. Les instruments sont stérilisés de la même manière après travail avec des bactéries suscitant la controverse.
Seules des personnes spécialement formées sont autorisées à travailler avec l'autoclave, qui doivent suivre strictement et avec précision les règles spécifiées dans les instructions jointes à l'appareil.
Technique d'autoclavage... 1. Avant le travail, vérifiez le bon fonctionnement de toutes les pièces et l'usure des robinets.
2. L'eau (distillée ou bouillie pour ne pas former de tartre) est versée dans l'eau (distillée ou bouillie) à travers un entonnoir, fixé à l'extérieur de la chaudière, jusqu'au repère supérieur du verre jauge. Le robinet sous l'entonnoir est fermé.
3. Le matériel à stériliser est placé dans la chambre de stérilisation sur une grille spéciale. Les articles ne doivent pas être chargés trop étroitement, car la vapeur doit passer librement entre eux, sinon ils ne chaufferont pas à la température souhaitée et peuvent rester non stériles.
4. Le joint en caoutchouc du couvercle est frotté à la craie pour une meilleure étanchéité.
5. Le couvercle est fermé et boulonné au corps de l'autoclave, et les boulons sont serrés par paires en croix.
6. Ouvrir le robinet de vidange reliant la chambre de stérilisation à l'air extérieur jusqu'à ce qu'il s'arrête et commencer à chauffer l'autoclave. L'autoclave est généralement chauffé au gaz ou à l'électricité.
Lorsque l'autoclave est chauffé, l'eau bout, la vapeur générée monte entre les parois des chaudières et à travers des trous spéciaux dans la paroi de la chaudière intérieure (voir Fig. 12), pénètre dans la chambre de stérilisation et sort par le robinet de vidange ouvert. Tout d'abord, la vapeur est libérée avec l'air dans l'autoclave. Il est impératif que tout l'air soit expulsé de l'autoclave, sinon le manomètre ne correspondra pas à la température dans l'autoclave.
L'apparition d'un fort jet de vapeur continu indique une élimination complète de l'air de l'autoclave ; après cela, la vanne de sortie est fermée et la pression à l'intérieur de l'autoclave commence à augmenter progressivement.
7. Le début de la stérilisation est considéré comme le moment où les lectures du manomètre atteignent la valeur spécifiée. Le chauffage est régulé de manière à ce que la pression dans l'autoclave ne change pas pendant un certain temps.
8. Une fois le temps de stérilisation écoulé, le chauffage de l'autoclave est arrêté, la vapeur est libérée par la vanne de sortie. Lorsque l'aiguille du manomètre tombe à zéro, ouvrez le couvercle. Pour éviter les brûlures par la vapeur piégée dans l'autoclave, ouvrez le couvercle vers vous.
Le niveau de température dans l'autoclave, c'est-à-dire la lecture correcte du manomètre, peut être vérifié. Pour cela, différentes substances sont utilisées qui ont un point de fusion spécifique : antipyrine (113°C), résorcinol et soufre (119°C), acide benzoïque (120°C). L'une de ces substances est mélangée avec une quantité négligeable de colorant (fuchsine ou bleu de méthylène) et versée dans un tube en verre, qui est scellé et placé en position verticale entre le matériel à stériliser. Si la température est suffisante, la substance fondra et se colorera avec le colorant correspondant.
Pour vérifier l'efficacité de la stérilisation, un tube à essai avec une culture de spores connue est placé dans l'autoclave. Après autoclavage, le tube est transféré dans un thermostat pendant 24 à 48 heures, l'absence ou la présence de croissance est constatée. L'absence de croissance indique le bon fonctionnement de l'appareil.
Stérilisation à la vapeur d'eau produit dans l'appareil de Koch. Cette méthode est utilisée dans les cas où l'objet à stériliser évolue à une température supérieure à 100°C. Avec un courant de vapeur, les milieux de culture contenant de l'urée, des glucides, du lait, des pommes de terre, de la gélatine, etc. sont stérilisés.
L'appareil de Koch (chaudière) est un cylindre métallique gainé à l'extérieur (pour réduire le transfert de chaleur) avec du feutre ou de l'amiante. Le cylindre est fermé par un couvercle conique avec une sortie de vapeur. Il y a un support à l'intérieur du cylindre, au niveau duquel de l'eau est versée. Un seau avec un trou est placé sur le support, dans lequel le matériel à stériliser est placé. L'appareil Koch est chauffé au gaz ou à l'électricité. Le temps de stérilisation est compté à partir du moment où la vapeur s'échappe vigoureusement sur les bords du couvercle et à partir de la sortie de vapeur. Stérilisé dans les 30-60 minutes. A la fin de la stérilisation, le chauffage est arrêté. Retirer le seau avec le matériel de l'appareil et laisser à température ambiante jusqu'au lendemain. L'échauffement est effectué pendant 3 jours consécutifs à une température de 100 ° C pendant 30 à 60 minutes. Cette méthode est appelée stérilisation fractionnée. Au premier chauffage, les formes végétatives des microbes meurent et les spores restent. Pendant la journée, les spores ont le temps de germer et de se transformer en formes végétatives, qui meurent le deuxième jour de stérilisation. Puisqu'il est possible que certaines des spores n'aient pas eu le temps de germer, le matériel est conservé pendant encore 24 heures, puis une troisième stérilisation est effectuée. La stérilisation à la vapeur qui coule dans l'appareil Koch ne nécessite pas de contrôle particulier, car la stérilité des milieux de culture préparés sert d'indicateur du bon fonctionnement de l'appareil. Vous pouvez également stériliser à la vapeur qui coule dans un autoclave avec le couvercle ouvert et la vanne de vidange ouverte.
Questions de contrôle
1. Quels milieux de culture sont stérilisés à la vapeur ?
2. Qu'est-ce qu'un stérilisateur et comment fonctionne-t-il ?
3. Pourquoi utiliser de l'eau distillée pour la stérilisation par ébullition ?
4. Décrire le dispositif et le mode de fonctionnement de l'autoclave.
5. Qu'est-ce qui est autoclavable ?
6. Qu'est-ce qui permet de contrôler correctement la stérilisation pendant l'autoclavage ?
7. Qu'est-ce que la stérilisation à la vapeur fluide ?
8. Décrivez le dispositif de l'appareil de Koch.
9. Quel est le but de la stérilisation fractionnée ?
Exercer
Remplir le formulaire.
La stérilisation fractionnée peut également être réalisée dans un coagulant de Koch.
Le coagulant de Koch est utilisé pour la coagulation du lactosérum et des milieux de culture d'œufs, et simultanément au compactage du milieu, il est stérilisé.
Coagulateur de Koch est une boîte métallique plate à double paroi recouverte à l'extérieur matériau d'isolation thermique... L'eau est versée dans l'espace entre les murs à travers un trou spécial situé dans la partie supérieure du mur extérieur. Le trou est fermé par un bouchon dans lequel le thermomètre est inséré. L'appareil est fermé par deux couvercles : en verre et en métal. Le processus de laminage peut être observé à travers le couvercle en verre. Des tubes à essai avec des milieux sont placés au fond du coagulant dans une position inclinée.
Le coagulant est chauffé au gaz ou à l'électricité. Les milieux sont stérilisés une fois à une température de 90 °C pendant 1 heure ou de façon fractionnée - 3 jours d'affilée à 80 °C pendant 1 heure.
Tyndalisation* - stérilisation fractionnée à basse température - utilisée pour les substances facilement détruites et dénaturées à une température de 60 ° C (par exemple, les liquides protéiques). Le matériel à stériliser est chauffé dans un bain-marie ou dans des appareils spéciaux avec thermostats à une température de 56-58 ° C pendant une heure pendant 5 jours consécutifs.
* (La méthode de stérilisation porte le nom de Tyndall, qui l'a proposée.)
Pasteurisation- la stérilisation à 65-70°C pendant 1 heure, proposée par Pasteur pour la destruction des formes non sporulées des microbes. Le lait, le vin, la bière, les jus de fruits et autres produits sont pasteurisés. Le lait est pasteurisé pour le libérer de l'acide lactique et des bactéries pathogènes (Brucella, Mycobacterium tuberculosis, Shigella, Salmonella, Staphylococcus, etc.). Lors de la pasteurisation de la bière, des jus de fruits, du vin, les micro-organismes qui provoquent divers types de fermentation sont tués. Les aliments pasteurisés sont mieux conservés au froid.
Questions de contrôle
1. Quel est le but et le dispositif du coagulant de Koch ?
2. Quelles sont les méthodes de stérilisation dans un coagulant ?
3. Qu'est-ce que la tyndalisation ?
4. Qu'est-ce que la pasteurisation ?
Stérilisation par irradiation ultraviolette
La stérilisation par rayons UV est réalisée à l'aide d'installations spéciales - lampes bactéricides. Les rayons UV ont une activité antimicrobienne élevée et peuvent provoquer la mort non seulement des cellules végétatives, mais aussi des spores. L'irradiation UV est utilisée pour stériliser l'air dans les hôpitaux, les salles d'opération, les institutions pour enfants, etc. Au laboratoire de microbiologie, la boîte est traitée aux rayons UV avant le travail.
Questions de contrôle
1. Quelles sont les propriétés des rayons ultraviolets ?
2. Quand utilise-t-on la stérilisation aux ultraviolets ?
Stérilisation mécanique avec filtres bactériens
La stérilisation par filtre est utilisée lorsque les articles à stériliser changent lorsqu'ils sont chauffés. La filtration est réalisée à l'aide de filtres bactériens constitués de divers matériaux finement poreux. Les pores du filtre doivent être suffisamment petits (jusqu'à 1 micron) pour permettre une rétention mécanique des bactéries ; par conséquent, certains auteurs attribuent la filtration aux méthodes de stérilisation mécanique.
La méthode de filtrage stérilise les milieux de culture contenant des protéines, du sérum, certains antibiotiques, et sépare également les bactéries des virus, des phages et des exotoxines.
Dans la pratique microbiologique, on utilise des filtres à amiante Seitz, des filtres à membrane et des filtres (bougies) de Chamberlan et Berkefeld.
Les filtres Seitz sont des disques fabriqués à partir d'un mélange d'amiante et de cellulose. Leur épaisseur est de 3 à 5 mm, leur diamètre de 35 à 140 mm. L'industrie nationale fabrique des filtres de deux qualités : « F » (filtrage) - retenant les particules en suspension, mais laissant passer les bactéries ; "SF" (stérilisant) - avec des pores plus petits, retenant les bactéries, mais permettant les virus. Les plaques d'amiante froissées, ainsi que les plaques présentant des cassures et des fissures, ne conviennent pas au travail.
Les filtres à membrane sont fabriqués à partir de nitrocellulose. Ce sont des disques blancs d'une épaisseur de 0,1 mm et d'un diamètre de 35 mm. Selon la taille des pores, ils sont désignés par les n° 1, 2, 3, 4 et 5 (tableau 3).
Le filtre n ° 1 est le plus approprié pour la stérilisation. En plus de ceux énumérés, un pré-filtre est également produit, conçu pour libérer le liquide filtré des grosses particules qu'il contient.
Les filtres (bougies) de Chamberlain et Berkefeld sont des cylindres creux fermés à une extrémité. Les bougies Chamberlain sont fabriquées à partir de kaolin mélangé à du sable et du quartz. Ils sont standardisés en termes de tailles de pores et désignés L 1, L 2, L 3 ... L 13. Les filtres (bougies) de Berkefeld sont préparés à partir de sol à infuseur, selon la taille de leurs pores ils sont désignés V, N, W, ce qui correspond à un diamètre de pores de 3-4, 4-7, 8-12 microns.
Le travail avec des filtres bactériens est effectué comme suit. Le filtre doit être fixé dans un support spécial qui est inséré dans le réceptacle du filtre. Le récepteur est généralement une fiole Bunsen. Les supports, dans la plupart des cas en acier inoxydable, se composent de deux parties : la partie supérieure, qui a la forme d'un cylindre sans fond, et la partie inférieure, qui se termine par un tube. Les filtres Seitz sont placés avec la surface rugueuse vers le haut sur un treillis métallique et sont fermement serrés avec des vis entre le haut et le bas du support. Le filtre assemblé est fixé dans un bouchon en caoutchouc inséré dans le col de la fiole Bunsen. Un coton-tige est inséré dans le tube de sortie du flacon, qui est connecté à une pompe à vide. L'installation préparée est enveloppée dans du papier et stérilisée dans un autoclave sous une pression de 1 atm pendant 20-30 minutes. L'ensemble du dispositif assemblé est également appelé filtre Seitz (Fig. 13).
Immédiatement avant la filtration, l'extrémité ramifiée de la fiole Bunsen est reliée par un tube en caoutchouc à une pompe à huile ou à jet d'eau. Points de connexion Différents composants versé avec de la paraffine pour créer une étanchéité. Le liquide filtré est versé dans le cylindre de l'appareil et la pompe est mise en marche, créant un vide dans le récepteur. En raison de la différence de pression qui en résulte, le liquide filtré passe à travers les pores du filtre dans le récepteur, tandis que les microbes restent à la surface du filtre.
Les filtres à membrane sont stérilisés par ébullition dans de l'eau distillée avant utilisation. Pour éviter que les filtres ne se tordent, ils sont d'abord placés dans de l'eau distillée, chauffée à une température de 50-60 ° C et bouillis à feu doux pendant 30 minutes, en changeant l'eau 2 à 3 fois. Le porte-filtre et le récepteur sont préalablement stérilisés, l'appareil est monté dans des conditions aseptiques. Afin de ne pas déchirer la membrane filtrante sur le grillage métallique, des tasses de papier filtre stérile sont placées en dessous. Ensuite, à l'aide d'une pince à épiler stérile à bouts lisses, retirez la membrane filtrante du stérilisateur et placez-la sur la grille de support avec la surface brillante vers le bas.
Les bougies (Chamberlain) stérilisées dans un autoclave sont reliées au moyen d'un tube en caoutchouc avec un récepteur et descendues dans un récipient (généralement un cylindre) avec le liquide à filtrer. La filtration s'effectue à l'aide d'une pompe à vide. Un filtrat stérile pénètre dans le récepteur et les bactéries sont retenues par les pores de la bougie.
Les filtres à membrane et à amiante sont à usage unique. Après utilisation, les bougies sont bouillies dans l'eau du robinet, puis calcinées dans un four à moufle.
Avant toute utilisation ultérieure, l'intégrité des bougies est vérifiée. La bougie est immergée dans un récipient d'eau et l'air y passe. Si des bulles d'air apparaissent à la surface de la bougie, des fissures se sont formées dans la bougie et elle est inutilisable.
Questions de contrôle
1. Quelle est la méthode de stérilisation par filtre ? Qu'est-ce qui est stérilisé par cette méthode ?
2. Quels filtres bactériens connaissez-vous ? Comment est monté le dispositif de filtration, quelles conditions doivent être respectées ?
Méthodes chimiques
Ce type de stérilisation est peu utilisé et sert principalement à éviter la contamination bactérienne des milieux de culture et des préparations immunobiologiques (vaccins et sérums).
Des substances telles que le chloroforme, le toluène et l'éther sont le plus souvent ajoutées aux milieux nutritifs. S'il est nécessaire de débarrasser le milieu de ces conservateurs, il est chauffé au bain-marie à 56°C (les conservateurs s'évaporent).
Pour conserver les vaccins, les sérums, ils utilisent du merthiolate, de l'acide borique, du formol, etc.
Stérilisation biologique
La stérilisation biologique est basée sur l'utilisation d'antibiotiques. Cette méthode est utilisée dans la culture de virus.
Questions de contrôle
1. Qu'est-ce que la stérilisation chimique et quand est-elle utilisée ?
2. Qu'est-ce que la stérilisation biologique ?
Les principales méthodes de stérilisation sont présentées dans le tableau. 4.
1 (Stérilisation incomplète : des spores restent dans le matériel à stériliser.)
2 (Stérilisation incomplète : des virus restent dans le matériel à stériliser.)
Désinfection
Dans la pratique microbiologique, divers désinfectants sont utilisés : solutions de phénol 3-5%, solutions de lysol 5-10%, solutions de chloramine 1-5%, solutions de peroxyde d'hydrogène 3-6%, solutions de formol 1-5%, solutions de chlorure mercurique dans un dilution de 1: 1000 (0,1%), 70° d'alcool, etc.
Les déchets pathologiques (pus, selles, urine, crachats, sang, liquide céphalo-rachidien) sont désinfectés avant d'être évacués dans les égouts. La désinfection est effectuée avec de l'eau de Javel sèche ou une solution de chloramine à 3-5 %.
Les pipettes contaminées par du matériel pathologique ou des cultures de microorganismes (gradués et Pasteur), les spatules en verre, les lames et lamelles sont plongées pendant une journée dans des bocaux en verre avec une solution à 3% de phénol ou de peroxyde d'hydrogène.
A la fin des travaux avec du matériel infectieux, le technicien de laboratoire doit traiter avec une solution désinfectante lieu de travail et les mains. La surface de la table de travail est essuyée avec un morceau de coton imbibé d'une solution de phénol à 3 %. Les mains sont désinfectées avec une solution de chloramine à 1%. Pour ça boule de coton ou une serviette en gaze est humidifiée avec une solution désinfectante et essuyée avec la main gauche, puis la droite, puis lavez-vous les mains eau chaude avec du savon.
Le choix d'un désinfectant, sa concentration et sa durée d'exposition (exposition) dépendent des propriétés biologiques du microbe et de l'environnement dans lequel le désinfectant va entrer en contact avec des micro-organismes pathogènes. Par exemple, le chlorure mercurique, le phénol, les alcools ne conviennent pas à la désinfection des substrats protéiques (pus, sang, crachats), car sous leur influence, une coagulation des protéines se produit et la protéine coagulée protège les micro-organismes des effets des désinfectants.
Lors de la désinfection du matériel infecté par des formes de spores de micro-organismes, une solution à 5 % de chloramine, 1 à 2,5 % de solutions de chloramine activée, 5 à 10 % de solutions de formol et d'autres substances sont utilisées.
La désinfection, qui est effectuée tout au long de la journée au cours des travaux, est appelée actuelle et à la fin des travaux - finale.
Désinfectants et recettes pour la préparation de solutions de travail à partir d'eux... L'eau de Javel est une poudre blanche grumeleuse avec une odeur piquante de chlore ; elle ne se dissout pas complètement dans l'eau. L'effet bactéricide dépend de la teneur en chlore actif, dont la quantité varie de 28 à 36%. L'eau de Javel contenant moins de 25 % de chlore actif ne convient pas pour la désinfection.
S'il n'est pas stocké correctement, l'eau de Javel se décompose et perd une partie du chlore actif. La décomposition est facilitée par la chaleur, l'humidité, la lumière du soleil, par conséquent, l'eau de Javel doit être stockée dans un endroit sec et sombre, dans un récipient bien fermé.
L'eau de Javel sèche est utilisée pour désinfecter les sécrétions humaines et animales (à raison de 200 g pour 1 litre de matières fécales et 10 g pour 1 litre d'urine).
Préparation de la solution d'eau de Javel clarifiée d'origine à 10 %. Prenez 1 kg d'eau de Javel sèche, placez-la dans un seau en émail et broyez. Puis versez eau froideà un volume de 10 litres, bien mélanger, couvrir avec un couvercle et laisser reposer une journée dans un endroit frais. Après cela, la solution clarifiée à 10% résultante est soigneusement égouttée et filtrée à travers plusieurs couches de gaze ou filtrée à travers un tissu dense. Conserver dans des bouteilles en verre foncé, fermées par un bouchon en bois, dans un endroit frais, pas plus de 10 jours. Des solutions de travail de la concentration requise sont préparées à partir de la solution mère immédiatement avant leur utilisation. La quantité de solution basique requise pour la préparation de solutions clarifiées d'eau de Javel à 0,2-10% est indiquée dans le tableau. 5.
La concentration des solutions clarifiées d'eau de Javel de 0,2 à 10 % est choisie en fonction de la nature de l'objet à désinfecter et de la stabilité de l'agent pathogène.
La chloramine est une substance cristalline blanche ou jaunâtre, contient 24-28% de chlore actif. Il se dissout bien dans l'eau à température ambiante, ses solutions sont donc préparées immédiatement avant la désinfection. Ils utilisent des solutions de chloramine à 0,2-10%. Le rapport entre la concentration en pourcentage de la solution et la quantité de chloramine en grammes pour 1 et 10 litres est donné dans le tableau. 6.
Dissoudre la chloramine dans un bol en verre ou en émail. Lors du stockage des solutions de chloramine dans un plat en verre foncé avec un bouchon rodé, leur activité persiste jusqu'à 15 jours.
Chloramine activée. Les propriétés désinfectantes de la chloramine sont renforcées lorsqu'un activateur lui est ajouté dans un rapport de 1: 1 ou 1: 2. En tant qu'activateur, des composés d'ammonium sont utilisés - chlorure, sulfate, nitrate d'ammonium. La chloramine activée est utilisée à une concentration de 0,5, 1 et 2,5 %. Préparez-les immédiatement avant utilisation. La chloramine et le sel d'ammonium sont pesés séparément. Tout d'abord, la chloramine est dissoute dans l'eau, puis l'activateur est ajouté.
L'avantage des solutions de chloramine activée par rapport aux solutions conventionnelles est que lorsqu'un activateur est ajouté, la libération de chlore actif est accélérée. Par conséquent, le médicament a un effet néfaste non seulement sur les formes végétatives des micro-organismes, mais également sur leurs spores. La chloramine activée est utilisée à des concentrations plus faibles et à une exposition plus faible.
Le phénol (acide phénique) est un cristal incolore en forme d'aiguille avec une odeur caractéristique piquante. Sous l'influence de la lumière, de l'air et de l'humidité, les cristaux acquièrent une couleur rouge framboise. Conserver dans des bocaux en verre foncé fermés et à l'abri de la lumière.
Le phénol est soluble dans l'eau, l'alcool, l'éther, les huiles grasses. Étant très hygroscopique, il absorbe l'humidité de l'environnement et devient liquide. L'acide phénique liquide contient 90 % de phénol cristallin et 10 % d'eau.
Appliquer des solutions aqueuses à 3-5% d'acide phénique préparées à partir de phénol cristallin et d'acide phénique liquide selon le schéma indiqué dans le tableau. 7. L'activité du phénol augmente lorsqu'il est dissous dans eau chaude(40-50 °C).
Attention! Le phénol cristallin ou l'acide phénique liquide au contact de la peau peut provoquer une irritation de la peau et, à des concentrations élevées, de graves brûlures. Par conséquent, il faut faire très attention lors de la manipulation de l'acide phénique. Lorsque vous préparez des solutions, vous devez porter des gants en caoutchouc ou, dans les cas extrêmes, vous lubrifier les mains avec de la vaseline.
Si de l'acide phénique entre en contact avec la peau, lavez-la immédiatement avec de l'eau tiède et du savon ou de l'alcool éthylique à 40 °.
Noter. Pour la préparation de solutions désinfectantes de phénol, il est plus pratique et plus sûr d'utiliser de l'acide phénique liquide.
Questions de contrôle
1. Quels désinfectants sont utilisés dans la pratique microbiologique ?
2. Décrivez apparence et les principales propriétés de l'eau de Javel, de la chloramine, du phénol.
3. Quelles solutions de désinfectants sont utilisées pour désinfecter le matériel infecté par des spores de micro-organismes ?
Exercer
Préparez 2 litres de solution de travail à 5 % d'eau de Javel clarifiée ; 500 ml de solution de chloramine à 3%, 300 ml de solution de chloramine activée à 1%.
Attention! Avant de procéder à la préparation des solutions, effectuez les calculs.
L'effet de la température sur les micro-organismes.
La température est un facteur important affectant les fonctions vitales des micro-organismes. Pour les micro-organismes, il existe des températures minimales, optimales et maximales. Optimal- la température à laquelle se produit la reproduction la plus intensive des microbes. Le minimum- la température en dessous de laquelle les microorganismes sont inactifs. Maximum- la température au-dessus de laquelle se produit la mort des micro-organismes.
En fonction de la température, on distingue 3 groupes de micro-organismes :
2. Mésophiles. Optimale - 30-37°C... Le minimum - 15-20 ° C Maximum - 43-45°C Ils vivent dans le corps des animaux à sang chaud. Ceux-ci incluent la plupart des micro-organismes pathogènes et opportunistes.
3... Thermophiles. Optimale - 50-60°C Le minimum - 45°C Maximum - 75°C... Ils vivent dans des sources chaudes, participent aux processus d'auto-échauffement du fumier et des céréales. Ils ne sont pas capables de se reproduire dans le corps des animaux à sang chaud, ils n'ont donc aucune valeur médicale.
Action bénéfique température optimale utilisé pour la culture de micro-organismes à des fins de diagnostic en laboratoire, de préparation de vaccins et d'autres médicaments.
Freinage basses températures utilisé pour le stockage produits et cultures de micro-organismes dans un réfrigérateur. La basse température suspend les processus de putréfaction et de fermentation. Le mécanisme d'action des basses températures est l'inhibition des processus métaboliques dans la cellule et le passage à un état d'animation suspendue.
Action destructrice température élevée (au-dessus du maximum) utilisé pour la stérilisation . Mécanisme actions - dénaturation des protéines (enzymes), dommages aux ribosomes, violation de la barrière osmotique. Les psychrophiles et les mésophiles sont les plus sensibles à l'action des températures élevées. Un particulier durabilité Afficher des disputes bactéries.
L'action de l'énergie rayonnante et des ultrasons sur les micro-organismes.
Faites la distinction entre les rayonnements non ionisants (rayons ultraviolets et infrarouges du soleil) et les rayonnements ionisants (rayons g et électrons de haute énergie).
Les rayonnements ionisants ont un puissant effet pénétrant et endommagent le génome cellulaire. Mécanisme action dommageable : ionisation macromolécules, qui s'accompagne du développement de mutations ou de la mort cellulaire. Dans le même temps, les doses létales pour les micro-organismes sont plus élevées que pour les animaux et les plantes.
Mécanisme action dommageable rayons UV: la formation de dimères de thymine dans la molécule d'ADN , qui arrête la division cellulaire et est la principale cause de leur mort. L'effet nocif des rayons UV est plus prononcé pour les micro-organismes que pour les animaux et les plantes.
Ultrason(ondes sonores 20 mille Hz) a un effet bactéricide. Mécanisme: éducation dans le cytoplasme de la cellule cavités de cavitation , qui sont remplis de vapeurs liquides et une pression allant jusqu'à 10 000 atm s'y produit. Cela conduit à la formation de radicaux hydroxyles très réactifs, à la destruction des structures cellulaires et à la dépolymérisation des organites, à la dénaturation des molécules.
Les rayonnements ionisants, les rayons UV et les ultrasons sont utilisés pour la stérilisation.
L'effet du séchage sur les micro-organismes.
L'eau est essentielle au fonctionnement normal des micro-organismes. Une diminution de l'humidité de l'environnement entraîne le passage des cellules à un état de dormance, puis à la mort. Mécanisme effet destructeur du séchage : déshydratation du cytoplasme et dénaturation des protéines.
Les micro-organismes pathogènes sont plus sensibles au dessèchement : agents pathogènes de la gonorrhée, de la méningite, de la fièvre typhoïde, de la dysenterie, de la syphilis, etc. Plus résistants sont les spores bactériennes, les kystes de protozoaires, les bactéries protégées par le mucus des crachats (bacilles tuberculeux).
En pratique le séchage est utilisé pour la mise en conserve viande, poisson, légumes, fruits, lors de la récolte des herbes médicinales.
Séchage à partir d'un état congelé sous vide - lyophilisation ou lyophilisation. C'est utilisé préserver les récoltes les micro-organismes qui dans cet état pendant des années (10-20 ans) ne perdent pas leur viabilité et ne changent pas leurs propriétés. Dans le même temps, les micro-organismes sont dans un état d'animation suspendue. La lyophilisation est utilisée dans la fabrication de médicamentsà partir de micro-organismes vivants : eubiotiques, phages, vaccins vivants contre la tuberculose, la peste, la tularémie, la brucellose, la grippe, etc.
L'effet des facteurs chimiques sur les micro-organismes.
Les produits chimiques affectent les micro-organismes de différentes manières. Cela dépend de la nature, de la concentration et du temps d'action des produits chimiques. Ils peuvent stimuler la croissance(utilisés comme sources d'énergie), fournir microbicide, microbostatique, action mutagène ou peut être indifférent aux processus de la vie
Par exemple : une solution de glucose à 0,5-2% est une source de nourriture pour les microbes, et une solution à 20-40% a un effet dépressif.
Pour les micro-organismes, il est nécessaire pH optimal du milieu... Pour la plupart des symbiotes et agents pathogènes des maladies humaines - un environnement neutre, légèrement alcalin ou légèrement acide. Avec une augmentation du pH, il passe plus souvent du côté acide, tandis que la croissance des micro-organismes s'arrête. Et puis la mort vient. Mécanisme: dénaturation des enzymes avec des ions hydroxyles, violation de la barrière osmotique de la membrane cellulaire.
Les produits chimiques qui possèdent action antimicrobienne, utilisé pour la désinfection, la stérilisation et la conservation.
L'action des facteurs biologiques sur les micro-organismes.
Les facteurs biologiques sont Formes variées l'influence des microbes les uns sur les autres, ainsi que l'effet des facteurs d'immunité (lysozyme, anticorps, inhibiteurs, phagocytose) sur les microorganismes pendant leur séjour dans le macroorganisme. Coexistence de différents organismes - symbiose... Il y a les suivants forme symbiose.
Mutualisme- une telle forme de cohabitation lorsque les deux partenaires bénéficient d'un bénéfice mutuel (par exemple, bactéries nodulaires et légumineuses).
Antagonisme- une forme de relation lorsqu'un organisme nuit (jusqu'à la mort) à un autre organisme avec ses produits métaboliques (acides, antibiotiques, bactériocines), en raison d'une meilleure adaptation aux conditions environnementales, par destruction directe (par exemple, microflore intestinale normale et agents pathogènes de l'intestin infection).
Métabiose- une forme de cohabitation, lorsqu'un organisme poursuit le processus provoqué par un autre (utilise ses déchets), et libère l'environnement de ces produits. Par conséquent, les conditions sont créées pour un développement ultérieur (bactéries nitrifiantes et ammonifiantes).
Satelliteisme- l'un des cohabitants stimule la croissance de l'autre (par exemple, les levures et les sarcins produisent des substances qui favorisent la croissance d'autres bactéries plus gourmandes en milieux nutritifs).
Le commensalisme- un organisme vit aux dépens de l'autre (bénéfices) sans lui nuire (par exemple, E. coli et le corps humain).
Prédation- relations antagonistes entre organismes, lorsque l'un en capture, en absorbe et en digère un autre (par exemple, l'amibe intestinale se nourrit de bactéries intestinales).
Stérilisation.
Stérilisation Est le processus de destruction complète de toutes les formes viables de microbes, y compris les spores, dans un objet.
Il existe 3 groupes de méthodes de stérilisation : physiques, chimiques et physico-chimiques. Méthodes physiques : stérilisation par haute température, irradiation UV, irradiation ionisante, ultrasons, filtration sur filtres stériles. Méthodes chimiques- l'utilisation de produits chimiques, ainsi que la stérilisation au gaz. Méthodes physico-chimiques- l'utilisation conjointe de méthodes physiques et chimiques. Par exemple, fièvre élevée et antiseptiques.
Stérilisation à haute température .
Cette méthode comprend : 1) stérilisation à la chaleur sèche; 2) stérilisation à la vapeur sous pression; 3) stérilisation à la vapeur fluide; 4) tyndalisation et pasteurisation; 5) calcination; 6) ébullition.
Stérilisation à la chaleur sèche.
Méthode basée sur l'action bactéricide de l'air chauffé à 165-170°C pendant 45 minutes.
Equipement : étuve sèche (four Pasteur)... Le poêle Pasteur est une armoire métallique à double paroi, gainée à l'extérieur d'un matériau peu conducteur de la chaleur (amiante). L'air chauffé circule dans l'espace entre les murs et sort par des ouvertures spéciales. Lors du travail, il est nécessaire de surveiller strictement la température et le temps de stérilisation requis. Si la température est plus élevée, il y aura carbonisation des tampons de coton, du papier dans lequel la vaisselle est enveloppée, et à une température plus basse, une stérilisation plus longue est nécessaire. À la fin de la stérilisation, l'armoire n'est ouverte qu'après refroidissement, sinon la verrerie peut se fissurer en raison d'un changement brusque de température.
a) articles en verre, métal, porcelaine, vaisselle, emballés dans du papier et fermés avec des bouchons en gaze de coton pour maintenir la stérilité (165-170 ° C, 45 min);
b) poudreux résistant à la chaleur médicaments- talc, argile blanche, oxyde de zinc (180-200°C, 30-60 min) ;
c) minéral et les huiles végétales, graisses, lanoline, vaseline, cire (180-200°C, 20-40 min).
Stérilisation à la vapeur sous pression.
La méthode la plus efficace et la plus largement utilisée dans la pratique microbiologique et clinique.
Méthode basée sur l'action hydrolysante de la vapeur sous pression sur les protéines de la cellule microbienne. L'action combinée de la haute température et de la vapeur assure une haute efficacité de cette stérilisation, dans laquelle les bactéries sporulées les plus persistantes sont tuées.
Équipement - autoclave. L'autoclave se compose de 2 cylindres métalliques insérés l'un dans l'autre avec un couvercle hermétique vissé avec des vis. La chaudière extérieure est une chambre à vapeur d'eau, la chaudière intérieure est une chambre de stérilisation. Il y a un manomètre, une soupape de décharge de vapeur, une soupape de sécurité, une jauge d'eau en verre. Dans la partie supérieure de la chambre de stérilisation, il y a un trou à travers lequel la vapeur passe de la chambre à vapeur d'eau. Le manomètre sert à déterminer la pression dans la chambre de stérilisation. Il existe une certaine relation entre la pression et la température : 0,5 atm - 112 ° C, 1-01,1 atm - 119-121 ° C, 2 atm - 134 ° C. Soupape de sécurité - pour protéger contre la surpression. Lorsque la pression monte au-dessus de la valeur de consigne, la vanne s'ouvre et libère l'excès de vapeur. Mode opératoire. De l'eau est versée dans l'autoclave dont le niveau est contrôlé par un verre doseur. Le matériel est placé dans la chambre de stérilisation et le couvercle est vissé fermement. La vanne de sortie de vapeur est ouverte. Allumez le chauffage. Une fois l'eau bouillie, le robinet ne se ferme que lorsque tout l'air a été déplacé ( la vapeur arrive jet sec fort et continu). Si la vanne est fermée plus tôt, les lectures du manomètre ne correspondront pas la bonne température... Une fois la vanne fermée, la pression dans la chaudière augmente progressivement. Le début de la stérilisation est le moment où la flèche du manomètre indique la pression de consigne. A la fin de la période de stérilisation, le chauffage est arrêté et l'autoclave est refroidi jusqu'à ce que l'aiguille du manomètre revienne à 0. Si la vapeur est libérée plus tôt, le liquide peut bouillir en raison d'un changement rapide de pression et pousser les bouchons ( la stérilité est violée). Lorsque l'aiguille du manomètre revient à 0, ouvrez avec précaution la vanne de décharge de vapeur, libérez la vapeur puis retirez les objets à stériliser. Si la vapeur ne se dégage pas après le retour de la flèche à 0, l'eau peut se condenser et mouiller les bouchons et le matériel à stériliser (la stérilité sera compromise).
Matériel et mode de stérilisation :
a) vaisselle en verre, métal, porcelaine, lin, bouchons en caoutchouc et en liège, produits en caoutchouc, cellulose, bois, pansements (laine de coton, gaze) (119 - 121 ° C, 20-40 min));
b) solution physiologique, solutions injectables, collyre, eau distillée, milieux nutritifs simples - MPB, MPA (119-121 ° C, 20-40 min);
c) huiles minérales, végétales dans des récipients hermétiquement fermés (119-121°C, 120 min) ;
Stérilisation à la vapeur d'eau.
Méthode basée sur l'action bactéricide de la vapeur (100°C) vis-à-vis des seules cellules végétatives.
Équipement- autoclave avec couvercle dévissé, ou Appareil de Koch.
Appareil de Koch - c'est un cylindre métallique à double fond, dont l'espace est rempli aux 2/3 d'eau. Dans le couvercle, il y a des trous pour un thermomètre et pour la sortie de vapeur. La paroi extérieure est revêtue d'un matériau peu conducteur de la chaleur (linoléum, amiante). Le début de la stérilisation est le temps entre l'ébullition de l'eau et l'entrée de la vapeur dans la chambre de stérilisation.
Matériel et mode de stérilisation. Cette méthode est utilisée pour stériliser le matériel, qui ne supporte pas des températures supérieures à 100°C: milieux nutritifs avec vitamines, glucides (milieux de Giss, Endo, Ploskirev, Levin), gélatine, lait.
À 100 ° C, les spores ne meurent pas, la stérilisation est donc effectuée plusieurs fois - stérilisation fractionnée - 20-30 minutes par jour pendant 3 jours.
Dans les intervalles entre les stérilisations, le matériel est maintenu à température ambiante afin que les spores germent sous des formes végétatives. Ils mourront lors d'un chauffage ultérieur à 100 ° C.
Tyndalisation et pasteurisation.
Tyndalisation - méthode de stérilisation fractionnée à des températures inférieures à 100°C. Ils sont utilisés pour stériliser des objets qui ne résistent pas à 100°C : sérum, liquide d'ascite, vitamines ... La tyndalisation est réalisée au bain-marie à 56°C pendant 1 heure pendant 5-6 jours.
Pasteurisation - partiel stérilisation (les spores ne meurent pas), qui est effectuée à une température relativement basse une fois. La pasteurisation est réalisée à 70-80°C pendant 5-10 minutes ou à 50-60°C pendant 15-30 minutes. La pasteurisation est utilisée pour les objets qui perdent leurs qualités à haute température.La pasteurisation, par exemple, utiliser pour certains produits alimentaires : lait, vin, bière ... Cela n'endommage pas leur valeur marchande, mais les spores restent viables, ces produits doivent donc être conservés au froid.
Calcination au feu. C'est une méthode de stérilisation fiable, mais son utilisation est limitée en raison de la détérioration des articles. De cette façon, les anses bactériologiques sont stérilisées.
Stérilisation à sec Chauffer. Réalisé au four Pasteur (tendon ------
armoire de niveau) à une température de 160-170 ° C pendant 1 heure. Cette méthode est utilisée pour stériliser la verrerie de laboratoire, les pipettes enveloppées dans du papier, les éprouvettes fermées par des bouchons en coton. À des températures supérieures à 170 ° C, la carbonisation du papier, du coton, de la gaze commence.
Stérilisation à la vapeur sous pression (autoclavage). La méthode de stérilisation la plus polyvalente. Elle est réalisée dans un autoclave - un stérilisateur eau-vapeur. Le principe de fonctionnement de l'autoclave est basé sur la dépendance du point d'ébullition de l'eau à la pression.
L'autoclave est une chaudière métallique à double paroi avec un couvercle hermétiquement fermé. De l'eau est versée dans le fond de l'autoclave, les éléments à stériliser sont placés dans la chambre de travail, le couvercle est fermé, d'abord sans le visser hermétiquement. Allumez le feu et portez l'eau à ébullition. La vapeur résultante déplace l'air de la chambre de travail, qui s'écoule par la vanne de sortie ouverte. Lorsque tout l'air a été déplacé et qu'un flux continu de vapeur s'écoule du robinet, le robinet est fermé, le couvercle est fermé hermétiquement. La vapeur est amenée à la pression requise sous le contrôle d'un manomètre. La température de la vapeur dépend de la pression : à pression atmosphérique normale, l'aiguille du manomètre est à 0 atm. - température de la vapeur 100 ° C, à 0,5 atm. - 112°С, à 1 atm. -121°C, à 1,5 atm. - 127°C, à 2 atm. - 134°C A la fin de la stérilisation, l'autoclave est éteint, la pression n'est pas réduite, la vapeur est progressivement libérée et le couvercle est ouvert. Généralement à une pression de 1 atm. dans les 20 à 40 minutes, les milieux nutritifs simples et les solutions qui ne contiennent pas de protéines et de glucides, les pansements et le linge sont stérilisés. Les matériaux à stériliser doivent être perméables à la vapeur. Lors de la stérilisation de matériaux en grands volumes (matériels chirurgicaux), le temps est augmenté à 2 heures. A une pression de 2 atm. désinfection du matériel pathologique et des cultures de déchets de microbes.
Les milieux de culture contenant des sucres ne peuvent pas être stérilisés à 1 atm., Au fur et à mesure qu'ils caramélisent, ils sont donc soumis à une stérilisation fractionnée à la vapeur d'eau, ou stérilisés à l'autoclave à 0,5 atm.
Des méthodes biologiques et physiques sont utilisées pour contrôler le régime de stérilisation. La méthode biologique est basée sur le fait que des spores de Bacillus stearothermophilus sont placées simultanément avec le matériel stérilisé, qui meurent à 121°C en 15 minutes. Après la stérilisation, les spores ne doivent pas pousser sur un milieu nutritif. La méthode physique est basée sur l'utilisation de substances ayant un point de fusion spécifique, par exemple le soufre (119 ° C), l'acide benzoïque (120 ° C). Des tubes scellés contenant la substance en mélange avec un colorant sec (fuchsine) sont placés dans un autoclave avec le matériel à stériliser. Si la température dans l'autoclave est suffisante, la substance fondra et prendra la couleur du colorant.
Stérilisation fluide vapeur_conduite dans un appareil Koch ou dans un autoclave avec le couvercle non vissé et la vanne de vidange ouverte. L'eau dans l'appareil est chauffée à 100°C. La vapeur qui en résulte traverse le matériau incrusté et le stérilise. Un seul traitement à 100°C ne tue pas les spores. Par conséquent, la méthode fractionnée de stérilisation est utilisée - 3 jours d'affilée pendant 30 minutes, en la laissant pendant une journée à température ambiante par intervalles. Le chauffage à 100 ° C provoque une activation thermique des spores, à la suite de laquelle elles germent sous des formes végétatives jusqu'au lendemain et meurent au cours du deuxième et du troisième chauffage. En conséquence, seuls les milieux de culture peuvent être stérilisés à la vapeur d'eau, car les nutriments sont nécessaires à la germination des spores.